மயோசின் கனரக சங்கிலிக்கு அப்பால் மனித எலும்புக்கூடு தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மை

nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் குறைந்த CSS ஆதரவு உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்கு, சமீபத்திய உலாவி பதிப்பைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்குதல்). கூடுதலாக, தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, இந்த தளம் ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் இருக்கும்.
எலும்பு தசை என்பது முக்கியமாக மயோபிப்ரில்களால் ஆன ஒரு பன்முகத்தன்மை கொண்ட திசு ஆகும், இது மனிதர்களில் பொதுவாக மூன்று வகைகளாக வகைப்படுத்தப்படுகிறது: ஒன்று "மெதுவான" (வகை 1) மற்றும் இரண்டு "வேகமான" (வகைகள் 2A மற்றும் 2X). இருப்பினும், பாரம்பரிய மயோபிப்ரில் வகைகளுக்கு இடையேயான பன்முகத்தன்மை இன்னும் சரியாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. மனித வாஸ்டஸ் லேட்டரலிஸிலிருந்து முறையே 1050 மற்றும் 1038 தனிப்பட்ட மயோபிப்ரில்களுக்கு டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் அணுகுமுறைகளைப் பயன்படுத்தினோம். புரோட்டியோமிக் ஆய்வில் ஆண்கள் அடங்குவர், மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் ஆய்வில் 10 ஆண்கள் மற்றும் 2 பெண்கள் அடங்குவர். மயோசின் கனரக சங்கிலி ஐசோஃபார்ம்களுக்கு கூடுதலாக, வளர்சிதை மாற்ற புரதங்கள், ரைபோசோமால் புரதங்கள் மற்றும் செல்லுலார் சந்திப்பு புரதங்கள் பல பரிமாண இடைமயோபிப்ரில் மாறுபாட்டின் ஆதாரங்களாக அடையாளம் கண்டோம். மேலும், மெதுவான மற்றும் வேகமான இழைகளின் கொத்துக்களை அடையாளம் கண்ட போதிலும், வகை 2X இழைகள் பிற வேகமான இழுப்பு இழைகளிலிருந்து பினோடிபிகலாக வேறுபடுத்த முடியாதவை என்று எங்கள் தரவு தெரிவிக்கிறது. மேலும், நெமலின் மயோபதிகளில் மயோஃபைபர் பினோடைப்பை விவரிக்க மயோசின் கனரக சங்கிலி அடிப்படையிலான வகைப்பாடு போதுமானதாக இல்லை. ஒட்டுமொத்தமாக, எங்கள் தரவு பல பரிமாண மயோஃபைபர் பன்முகத்தன்மையைக் குறிக்கிறது, மாறுபாட்டின் ஆதாரங்கள் மயோசின் கனரக சங்கிலி ஐசோஃபார்ம்களுக்கு அப்பால் நீண்டுள்ளன.
செல்லுலார் பன்முகத்தன்மை என்பது அனைத்து உயிரியல் அமைப்புகளின் உள்ளார்ந்த அம்சமாகும், இது செல்கள் திசுக்கள் மற்றும் செல்களின் வெவ்வேறு தேவைகளைப் பூர்த்தி செய்ய நிபுணத்துவம் பெற அனுமதிக்கிறது.1 எலும்பு தசை நார் பன்முகத்தன்மையின் பாரம்பரிய பார்வை என்னவென்றால், மோட்டார் நியூரான்கள் ஒரு மோட்டார் அலகுக்குள் உள்ள ஃபைபர் வகையை வரையறுக்கின்றன, மேலும் ஃபைபர் வகை (அதாவது, மனிதர்களில் வகை 1, வகை 2A, மற்றும் வகை 2X) மயோசின் கனரக சங்கிலி (MYH) ஐசோஃபார்ம்களின் பண்புகளால் தீர்மானிக்கப்படுகிறது.2 இது ஆரம்பத்தில் அவற்றின் pH ATPase உறுதியற்ற தன்மையை அடிப்படையாகக் கொண்டது,3,4 பின்னர் அவற்றின் MYH இன் மூலக்கூறு வெளிப்பாட்டை அடிப்படையாகக் கொண்டது.5 இருப்பினும், பல்வேறு விகிதாச்சாரங்களில் பல MYH களை இணைந்து வெளிப்படுத்தும் "கலப்பு" இழைகளை அடையாளம் கண்டு பின்னர் ஏற்றுக்கொண்டதன் மூலம், எலும்பு தசை நார்கள் தனித்துவமான ஃபைபர் வகைகளாக இல்லாமல் தொடர்ச்சியாகக் காணப்படுகின்றன.6 இதுபோன்ற போதிலும், இந்தத் துறை இன்னும் மயோஃபைபர் வகைப்பாட்டிற்கான முதன்மை வகைப்படுத்தியாக MYH ஐ பெரிதும் நம்பியுள்ளது, ஆரம்பகால கொறித்துண்ணி ஆய்வுகளின் வரம்புகள் மற்றும் குறிப்பிடத்தக்க சார்புகளால் பாதிக்கப்படும் ஒரு பார்வை, அதன் MYH வெளிப்பாடு சுயவிவரங்கள் மற்றும் ஃபைபர் வகைகளின் வரம்பு மனிதர்களிடமிருந்து வேறுபடுகின்றன.2 வெவ்வேறு மனித எலும்பு தசைகள் ஒரு பல்வேறு வகையான நார் வகைகள்.7 வாஸ்டஸ் லேட்டரலிஸ் என்பது ஒரு இடைநிலை (மற்றும் அதனால் பிரதிநிதித்துவப்படுத்தும்) MYH வெளிப்பாடு சுயவிவரத்தைக் கொண்ட ஒரு கலப்பு தசையாகும்.7 மேலும், அதன் மாதிரி எடுப்பின் எளிமை அதை மனிதர்களில் சிறப்பாக ஆய்வு செய்யப்பட்ட தசையாக ஆக்குகிறது.
எனவே, சக்திவாய்ந்த "ஓமிக்ஸ்" கருவிகளைப் பயன்படுத்தி எலும்பு தசை நார் பன்முகத்தன்மையின் பாரபட்சமற்ற விசாரணை மிகவும் முக்கியமானது, ஆனால் சவாலானது, எலும்பு தசை நார்களின் பன்முக அணுக்கரு தன்மை காரணமாக. இருப்பினும், டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ்8,9 மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ்10 தொழில்நுட்பங்கள் சமீபத்திய ஆண்டுகளில் பல்வேறு தொழில்நுட்ப முன்னேற்றங்கள் காரணமாக உணர்திறனில் ஒரு புரட்சியை ஏற்படுத்தியுள்ளன, இது ஒற்றை-ஃபைபர் தெளிவுத்திறனில் எலும்பு தசையின் பகுப்பாய்வை அனுமதிக்கிறது. இதன் விளைவாக, ஒற்றை-ஃபைபர் பன்முகத்தன்மையை வகைப்படுத்துவதிலும், அட்ரோபிக் தூண்டுதல்கள் மற்றும் வயதானவற்றுக்கு அவற்றின் எதிர்வினையிலும் குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றம் ஏற்பட்டுள்ளது11,12,13,14,15,16,17,18. முக்கியமாக, இந்த தொழில்நுட்ப முன்னேற்றங்கள் மருத்துவ பயன்பாடுகளைக் கொண்டுள்ளன, இது நோய் தொடர்பான ஒழுங்குமுறையின் விரிவான மற்றும் துல்லியமான தன்மையை அனுமதிக்கிறது. உதாரணமாக, மிகவும் பொதுவான மரபுவழி தசை நோய்களில் ஒன்றான நெமலின் மயோபதியின் நோய்க்குறியியல் (MIM 605355 மற்றும் MIM 161800), சிக்கலானது மற்றும் குழப்பமானது. 19,20 எனவே, எலும்பு தசை நார்களின் ஒழுங்குமுறை மீறலின் சிறந்த குணாதிசயம் இந்த நோயைப் பற்றிய நமது புரிதலில் குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றங்களுக்கு வழிவகுக்கும்.
மனித பயாப்ஸி மாதிரிகளிலிருந்து கைமுறையாக தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஒற்றை எலும்பு தசை நார்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்விற்கான முறைகளை நாங்கள் உருவாக்கி, ஆயிரக்கணக்கான இழைகளில் அவற்றைப் பயன்படுத்தினோம், இதனால் மனித எலும்பு தசை நார்களின் செல்லுலார் பன்முகத்தன்மையை ஆராய முடிந்தது. இந்த வேலையின் போது, ​​தசை நார்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பினோடைப்பிங்கின் சக்தியை நாங்கள் நிரூபித்தோம், மேலும் வளர்சிதை மாற்ற, ரைபோசோமால் மற்றும் செல்லுலார் சந்திப்பு புரதங்களை இன்டர்ஃபைபர் மாறுபாட்டின் குறிப்பிடத்தக்க ஆதாரங்களாக அடையாளம் கண்டோம். மேலும், இந்த புரோட்டியோமிக் பணிப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி, ஒற்றை எலும்பு தசை நார்களில் நெமடோட் மயோபதியின் மருத்துவ பொருத்தத்தை நாங்கள் வகைப்படுத்தினோம், இது MYH இன் அடிப்படையில் ஃபைபர் வகையிலிருந்து சுயாதீனமான ஆக்ஸிஜனேற்றமற்ற இழைகளை நோக்கி ஒருங்கிணைந்த மாற்றத்தை வெளிப்படுத்தியது.
மனித எலும்பு தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மையை ஆராய, ஒற்றை எலும்பு தசை நார்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மற்றும் புரோட்டியோம் பகுப்பாய்வை செயல்படுத்த இரண்டு பணிப்பாய்வுகளை நாங்கள் உருவாக்கினோம் (படம் 1A மற்றும் துணை படம் 1A). மாதிரி சேமிப்பு மற்றும் RNA மற்றும் புரத ஒருமைப்பாட்டைப் பாதுகாத்தல் முதல் ஒவ்வொரு அணுகுமுறைக்கும் செயல்திறனை மேம்படுத்துதல் வரை பல வழிமுறை படிகளை நாங்கள் உருவாக்கி மேம்படுத்தினோம். டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் பகுப்பாய்விற்கு, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் ஆரம்ப கட்டத்தில் மாதிரி-குறிப்பிட்ட மூலக்கூறு பார்கோடுகளைச் செருகுவதன் மூலம் இது அடையப்பட்டது, இது திறமையான கீழ்நிலை செயலாக்கத்திற்காக 96 இழைகளை ஒன்றிணைக்க அனுமதிக்கிறது. பாரம்பரிய ஒற்றை செல் அணுகுமுறைகளுடன் ஒப்பிடும்போது ஆழமான வரிசைமுறை (ஒரு ஃபைபருக்கு ±1 மில்லியன் வாசிப்புகள்) டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் தரவை மேலும் வளப்படுத்தியது. 21 புரோட்டியோமிக்ஸுக்கு, அதிக செயல்திறனைப் பராமரிக்கும் போது புரோட்டியோம் ஆழத்தை மேம்படுத்த ஒரு டைம்ஸ்TOF மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் DIA-PASEF தரவு கையகப்படுத்துதலுடன் இணைந்து ஒரு குறுகிய குரோமடோகிராஃபிக் சாய்வு (21 நிமிடங்கள்) பயன்படுத்தினோம். 22,23 ஆரோக்கியமான எலும்பு தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மையை ஆராய, 14 ஆரோக்கியமான வயதுவந்த நன்கொடையாளர்களிடமிருந்து 1,050 தனிப்பட்ட இழைகளின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்களையும், 5 ஆரோக்கியமான வயதுவந்த நன்கொடையாளர்களிடமிருந்து 1,038 இழைகளின் புரோட்டியோம்களையும் நாங்கள் வகைப்படுத்தினோம் (துணை அட்டவணை 1). இந்த ஆய்வறிக்கையில், இந்த தரவுத்தொகுப்புகள் முறையே 1,000-ஃபைபர் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்கள் மற்றும் புரோட்டியோம்கள் என குறிப்பிடப்படுகின்றன. எங்கள் அணுகுமுறை 1,000-ஃபைபர் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோம் பகுப்பாய்வுகளில் மொத்தம் 27,237 டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் 2,983 புரதங்களைக் கண்டறிந்தது (படம் 1A, துணை தரவுத்தொகுப்புகள் 1–2). >1,000 கண்டறியப்பட்ட மரபணுக்களுக்கான டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோம் தரவுத்தொகுப்புகளையும், ஒரு ஃபைபருக்கு 50% செல்லுபடியாகும் மதிப்புகளையும் வடிகட்டிய பிறகு, டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மற்றும் புரோட்டியமில் முறையே 925 மற்றும் 974 இழைகளுக்கு அடுத்தடுத்த உயிர் தகவலியல் பகுப்பாய்வுகள் செய்யப்பட்டன. வடிகட்டிய பிறகு, ஒரு ஃபைபருக்கு சராசரியாக 4257 ± 1557 மரபணுக்கள் மற்றும் 2015 ± 234 புரதங்கள் (சராசரி ± SD) கண்டறியப்பட்டன, வரையறுக்கப்பட்ட தனிநபர் மாறுபாடுடன் (துணை படங்கள் 1B–C, துணை தரவுத்தொகுப்புகள் 3–4). இருப்பினும், பங்கேற்பாளர்களிடையே உள்ள-பொருள் மாறுபாடு அதிகமாகக் காணப்பட்டது, வெவ்வேறு நீளம் மற்றும் குறுக்குவெட்டுப் பகுதிகளின் இழைகளுக்கு இடையே RNA/புரத விளைச்சலில் உள்ள வேறுபாடுகள் காரணமாக இருக்கலாம். பெரும்பாலான புரதங்களுக்கு (>2000), மாறுபாட்டின் குணகம் 20% க்கும் குறைவாக இருந்தது (துணை படம் 1D). இரண்டு முறைகளும் தசைச் சுருக்கத்திற்கு முக்கியமான (எ.கா., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) மிகவும் வெளிப்படுத்தப்பட்ட கையொப்பங்களுடன் கூடிய பரந்த டைனமிக் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் புரதங்களைப் பிடிக்க அனுமதித்தன (துணை படங்கள் 1E–F). அடையாளம் காணப்பட்ட பெரும்பாலான அம்சங்கள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் தரவுத்தொகுப்புகளுக்கு இடையில் பொதுவானவை (துணை படம் 1G), மேலும் இந்த அம்சங்களின் சராசரி UMI/LFQ தீவிரங்கள் நியாயமான முறையில் தொடர்புடையவை (r = 0.52) (துணை படம் 1H).
டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் பணிப்பாய்வு (BioRender.com உடன் உருவாக்கப்பட்டது). BD MYH7, MYH2 மற்றும் MYH1 க்கான டைனமிக் வரம்பு வளைவுகள் மற்றும் ஃபைபர் வகை ஒதுக்கீட்டிற்கான கணக்கிடப்பட்ட வரம்புகள். E, F டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்புகளில் இழைகள் முழுவதும் MYH வெளிப்பாட்டின் பரவல். G, H MYH- அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகையால் வண்ணமயமாக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸிற்கான சீரான பன்முகத்தன்மை தோராயமாக்கல் மற்றும் கணிப்பு (UMAP) வரைபடங்கள். I, J டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்புகளில் MYH7, MYH2 மற்றும் MYH1 வெளிப்பாட்டைக் காட்டும் அம்ச வரைபடங்கள்.
ஓமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்புகளில் MYH வெளிப்பாட்டின் உயர் உணர்திறன் மற்றும் மாறும் வரம்பைப் பயன்படுத்திக் கொள்ளும் உகந்த அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தி ஒவ்வொரு ஃபைபருக்கும் MYH-அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகையை ஒதுக்க நாங்கள் ஆரம்பத்தில் தொடங்கினோம். முந்தைய ஆய்வுகள் இழைகளை தூய வகை 1, வகை 2A, வகை 2X அல்லது வெவ்வேறு MYHகளின் வெளிப்பாட்டின் நிலையான சதவீதத்தின் அடிப்படையில் கலப்பு என லேபிளிட தன்னிச்சையான வரம்புகளைப் பயன்படுத்தியுள்ளன. ஒவ்வொரு ஃபைபரின் வெளிப்பாடும் ஃபைபர்களை தட்டச்சு செய்ய நாங்கள் பயன்படுத்திய MYHகளால் தரவரிசைப்படுத்தப்பட்ட ஒரு வேறுபட்ட அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தினோம்: MYH7, MYH2, மற்றும் MYH1, முறையே வகை 1, வகை 2A மற்றும் வகை 2X இழைகளுக்கு ஒத்திருக்கிறது. பின்னர் ஒவ்வொரு விளைவான வளைவின் கீழ் ஊடுருவல் புள்ளியை கணித ரீதியாகக் கணக்கிட்டு, ஒவ்வொரு MYHக்கும் நேர்மறை (வரம்புக்கு மேலே) அல்லது எதிர்மறை (வரம்புக்கு கீழே) என இழைகளை ஒதுக்க ஒரு வரம்பாகப் பயன்படுத்தினோம் (படம் 1B–D). இந்தத் தரவுகள், புரத அளவை விட RNA மட்டத்தில் MYH7 (படம் 1B) மற்றும் MYH2 (படம் 1C) ஆகியவை மிகவும் தனித்துவமான ஆன்/ஆஃப் வெளிப்பாடு சுயவிவரங்களைக் கொண்டுள்ளன என்பதைக் காட்டுகின்றன. உண்மையில், புரத மட்டத்தில், மிகக் குறைவான இழைகள் MYH7 ஐ வெளிப்படுத்தவில்லை, மேலும் எந்த இழையும் 100% MYH2 வெளிப்பாட்டைக் கொண்டிருக்கவில்லை. அடுத்து, ஒவ்வொரு தரவுத்தொகுப்பிலும் உள்ள அனைத்து இழைகளுக்கும் MYH- அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகைகளை ஒதுக்க முன்னரே தீர்மானிக்கப்பட்ட வெளிப்பாடு வரம்புகளைப் பயன்படுத்தினோம். எடுத்துக்காட்டாக, MYH7+/MYH2-/MYH1- இழைகள் வகை 1 க்கு ஒதுக்கப்பட்டன, அதே நேரத்தில் MYH7-/MYH2+/MYH1+ இழைகள் கலப்பு வகை 2A/2X க்கு ஒதுக்கப்பட்டன (முழு விளக்கத்திற்கு துணை அட்டவணை 2 ஐப் பார்க்கவும்). அனைத்து இழைகளையும் ஒன்றிணைத்து, RNA (படம் 1E) மற்றும் புரதம் (படம் 1F) நிலைகளில் MYH- அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகைகளின் குறிப்பிடத்தக்க ஒத்த விநியோகத்தைக் கண்டோம், அதே நேரத்தில் MYH- அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகைகளின் ஒப்பீட்டு கலவை எதிர்பார்த்தபடி தனிநபர்களிடையே மாறுபடுகிறது (துணை படம் 2A). பெரும்பாலான இழைகள் தூய வகை 1 (34–35%) அல்லது வகை 2A (36–38%) என வகைப்படுத்தப்பட்டன, இருப்பினும் கணிசமான எண்ணிக்கையிலான கலப்பு வகை 2A/2X இழைகளும் கண்டறியப்பட்டன (16–19%). ஒரு குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு என்னவென்றால், தூய வகை 2X இழைகளை RNA மட்டத்தில் மட்டுமே கண்டறிய முடியும், ஆனால் புரத மட்டத்தில் அல்ல, இது விரைவான MYH வெளிப்பாடு குறைந்தபட்சம் ஓரளவுக்குப் பிறகு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனாக கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.
ஆன்டிபாடி அடிப்படையிலான டாட் ப்ளாட்டிங்கைப் பயன்படுத்தி எங்கள் புரோட்டியோமிக்ஸ் அடிப்படையிலான MYH ஃபைபர் தட்டச்சு முறையை நாங்கள் சரிபார்த்தோம், மேலும் இரண்டு முறைகளும் தூய வகை 1 மற்றும் வகை 2A ஃபைபர்களை அடையாளம் காண்பதில் 100% உடன்பாட்டை அடைந்தன (துணை படம் 2B ஐப் பார்க்கவும்). இருப்பினும், புரோட்டியோமிக்ஸ் அடிப்படையிலான அணுகுமுறை மிகவும் உணர்திறன் வாய்ந்ததாகவும், கலப்பு இழைகளை அடையாளம் காண்பதில் மிகவும் திறமையானதாகவும், ஒவ்வொரு இழையிலும் ஒவ்வொரு MYH மரபணுவின் விகிதத்தையும் அளவிடுவதிலும் இருந்தது. இந்த தரவு எலும்பு தசை நார் வகைகளை வகைப்படுத்த ஒரு புறநிலை, அதிக உணர்திறன் கொண்ட ஓமிக்ஸ் அடிப்படையிலான அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்துவதன் செயல்திறனை நிரூபிக்கிறது.
பின்னர், டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் வழங்கிய ஒருங்கிணைந்த தகவல்களைப் பயன்படுத்தி, மயோஃபைபர்களை அவற்றின் முழுமையான டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் அல்லது புரோட்டியோமின் அடிப்படையில் புறநிலையாக வகைப்படுத்தினோம். பரிமாணத்தை ஆறு முக்கிய கூறுகளாகக் குறைக்க சீரான பன்மடங்கு தோராயமாக்கல் மற்றும் புரொஜெக்ஷன் (UMAP) முறையைப் பயன்படுத்தி (துணை படங்கள் 3A–B), டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் (படம் 1G) மற்றும் புரோட்டியோமில் (படம் 1H) மயோஃபைபர் மாறுபாட்டைக் காட்சிப்படுத்த முடிந்தது. குறிப்பாக, டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் அல்லது புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்புகளில் மயோஃபைபர்கள் பங்கேற்பாளர்களால் (துணை படங்கள் 3C–D) அல்லது சோதனை நாட்களால் (துணை படம் 3E) தொகுக்கப்படவில்லை, இது எலும்பு தசை நார்களில் உள்ள பொருளுக்குள் உள்ள மாறுபாடு, பொருளுக்கு இடையேயான மாறுபாட்டை விட அதிகமாக இருப்பதைக் குறிக்கிறது. UMAP ப்ளாட்டில், "வேகமான" மற்றும் "மெதுவான" மயோஃபைபர்களைக் குறிக்கும் இரண்டு தனித்துவமான கொத்துகள் தோன்றின (படங்கள் 1G–H). MYH7+ (மெதுவான) மயோஃபைபர்கள் UMAP1 இன் நேர்மறை துருவத்தில் கொத்தாக இருந்தன, அதேசமயம் MYH2+ மற்றும் MYH1+ (வேகமான) மயோஃபைபர்கள் UMAP1 இன் எதிர்மறை துருவத்தில் கொத்தாக இருந்தன (படங்கள் 1I–J). இருப்பினும், MYH வெளிப்பாட்டின் அடிப்படையில் வேகமான-இழுப்பு இழை வகைகளுக்கு (அதாவது, வகை 2A, வகை 2X, அல்லது கலப்பு 2A/2X) இடையே எந்த வேறுபாடும் செய்யப்படவில்லை, இது MYH1 (படம் 1I–J) அல்லது ACTN3 அல்லது MYLK2 (துணை புள்ளிவிவரங்கள் 4A–B) போன்ற பிற கிளாசிக்கல் 2X மயோஃபைபர் குறிப்பான்கள் முழு டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் அல்லது புரோட்டியமையும் கருத்தில் கொள்ளும்போது வெவ்வேறு மயோஃபைபர் வகைகளுக்கு இடையில் வேறுபடுவதில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. மேலும், MYH2 மற்றும் MYH7 உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​சில டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் அல்லது புரதங்கள் MYH1 உடன் நேர்மறையாக தொடர்புடையவை (துணை படம். 4C–H), இது MYH1 மிகுதியானது மயோஃபைபர் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்/புரோட்டியமை முழுமையாக பிரதிபலிக்கவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. UMAP மட்டத்தில் மூன்று MYH ஐசோஃபார்ம்களின் கலப்பு வெளிப்பாட்டை மதிப்பிடும்போது இதே போன்ற முடிவுகள் எட்டப்பட்டன (துணை படங்கள் 4I–J). எனவே, MYH அளவீட்டின் அடிப்படையில் மட்டும் 2X இழைகளை டிரான்ஸ்கிரிப்ட் மட்டத்தில் அடையாளம் காண முடியும் என்றாலும், முழு டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் அல்லது புரோட்டியோமைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது MYH1+ இழைகள் மற்ற வேகமான இழைகளிலிருந்து வேறுபடுவதில்லை.
MYH க்கு அப்பால் மெதுவான ஃபைபர் பன்முகத்தன்மையின் ஆரம்ப ஆய்வாக, TPM3, TNNT1, MYL3, மற்றும் ATP2A22 ஆகிய நான்கு நிறுவப்பட்ட மெதுவான ஃபைபர் வகை-குறிப்பிட்ட புரதங்களை நாங்கள் மதிப்பிட்டோம். மெதுவான ஃபைபர் துணை வகைகள், டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் (துணை படம் 5A) மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் (துணை படம் 5B) இரண்டிலும் MYH7 உடன் பியர்சன் தொடர்புகளை சரியாக இல்லாவிட்டாலும், அதிகமாகக் காட்டின. டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் (துணை படம் 5C) மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் (துணை படம் 5D) ஆகியவற்றில் உள்ள அனைத்து மரபணு/புரத துணை வகைகளாலும் தோராயமாக 25% மற்றும் 33% மெதுவான ஃபைபர்கள் தூய மெதுவான ஃபைபர்களாக வகைப்படுத்தப்படவில்லை. எனவே, பல மரபணு/புரத துணை வகைகளை அடிப்படையாகக் கொண்ட மெதுவான ஃபைபர் வகைப்பாடு, ஃபைபர் வகை-குறிப்பிட்டதாக அறியப்படும் புரதங்களுக்கு கூட கூடுதல் சிக்கலை அறிமுகப்படுத்துகிறது. ஒற்றை மரபணு/புரத குடும்பத்தின் ஐசோஃபார்ம்களை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஃபைபர் வகைப்பாடு எலும்பு தசை நார்களின் உண்மையான பன்முகத்தன்மையை போதுமான அளவு பிரதிபலிக்காது என்பதை இது குறிக்கிறது.
முழு ஓமிக்ஸ் மாதிரியின் அளவில் மனித எலும்புக்கூடு தசை நார்களின் பினோடைபிக் மாறுபாட்டை மேலும் ஆராய, முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) (படம் 2A) ஐப் பயன்படுத்தி தரவின் பக்கச்சார்பற்ற பரிமாணக் குறைப்பை நாங்கள் செய்தோம். UMAP வரைபடங்களைப் போலவே, பங்கேற்பாளரோ அல்லது சோதனை நாளோ PCA மட்டத்தில் ஃபைபர் கிளஸ்டரிங்கை பாதிக்கவில்லை (துணை புள்ளிவிவரங்கள் 6A–C). இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளிலும், MYH-அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகை PC2 ஆல் விளக்கப்பட்டது, இது மெதுவான-இழுப்பு வகை 1 இழைகளின் தொகுப்பையும், வேகமான-இழுப்பு வகை 2A, வகை 2X மற்றும் கலப்பு 2A/2X இழைகளைக் கொண்ட இரண்டாவது கிளஸ்டரையும் காட்டியது (படம் 2A). இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளிலும், இந்த இரண்டு கிளஸ்டர்களும் குறைந்த எண்ணிக்கையிலான கலப்பு வகை 1/2A இழைகளால் இணைக்கப்பட்டன. எதிர்பார்த்தபடி, முக்கிய PC இயக்கிகளின் அதிகப்படியான பிரதிநிதித்துவ பகுப்பாய்வு PC2 சுருக்க மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற கையொப்பங்களால் இயக்கப்படுகிறது என்பதை உறுதிப்படுத்தியது (படம் 2B மற்றும் துணை புள்ளிவிவரங்கள் 6D–E, துணை தரவுத்தொகுப்புகள் 5–6). ஒட்டுமொத்தமாக, MYH-அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகை, PC2 உடன் தொடர்ச்சியான மாறுபாட்டை விளக்க போதுமானதாகக் கண்டறியப்பட்டது, வேகமான கிளஸ்டருக்குள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் முழுவதும் விநியோகிக்கப்படும் 2X ஃபைபர்கள் என்று அழைக்கப்படுவதைத் தவிர.
A. MYH அடிப்படையில் ஃபைபர் வகையின்படி வண்ணமயமாக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மற்றும் புரோட்டியம் தரவுத்தொகுப்புகளின் முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) அடுக்குகள். B. PC2 மற்றும் PC1 இல் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் மற்றும் புரத இயக்கிகளின் செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு. கிளஸ்டர்ப்ரோஃபைலர் தொகுப்பு மற்றும் பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்யப்பட்ட p-மதிப்புகளைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. C, D. டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் உள்ள இன்டர்செல்லுலர் ஒட்டுதல் மரபணு ஆன்டாலஜி (GO) சொற்களின்படி வண்ணமயமாக்கப்பட்ட PCA அடுக்குகள் மற்றும் புரோட்டியமில் உள்ள கோஸ்டாமியர் GO சொற்கள். அம்புகள் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் மற்றும் புரத இயக்கிகள் மற்றும் அவற்றின் திசைகளைக் குறிக்கின்றன. E, F. மெதுவான/வேகமான ஃபைபர் வகையிலிருந்து சுயாதீனமான வெளிப்பாடு சாய்வுகளைக் காட்டும் மருத்துவ ரீதியாக பொருத்தமான அம்சங்களின் அடுக்குகளை சீரான பன்மடங்கு தோராயமாக்கல் மற்றும் ப்ரொஜெக்ஷன் (UMAP) கொண்டுள்ளது. G, H. டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்கள் மற்றும் புரோட்டியம்களில் PC2 மற்றும் PC1 இயக்கிகளுக்கு இடையிலான தொடர்புகள்.
எதிர்பாராத விதமாக, MYH-அடிப்படையிலான மயோஃபைபர் வகை இரண்டாவது மிக உயர்ந்த அளவிலான மாறுபாட்டை (PC2) மட்டுமே விளக்கியது, இது MYH-அடிப்படையிலான மயோஃபைபர் வகையுடன் (PC1) தொடர்பில்லாத பிற உயிரியல் காரணிகள் எலும்பு தசை நார் பன்முகத்தன்மையை ஒழுங்குபடுத்துவதில் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது. PC1 இல் உள்ள சிறந்த இயக்கிகளின் அதிகப்படியான பிரதிநிதித்துவ பகுப்பாய்வு, PC1 இல் உள்ள மாறுபாடு முதன்மையாக டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் உள்ள செல்-செல் ஒட்டுதல் மற்றும் ரைபோசோம் உள்ளடக்கம் மற்றும் புரோட்டியோமில் உள்ள கோஸ்டாமியர்கள் மற்றும் ரைபோசோமால் புரதங்களால் தீர்மானிக்கப்பட்டது என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 2B மற்றும் துணை புள்ளிவிவரங்கள் 6D–E, துணை தரவு தொகுப்பு 7). எலும்பு தசையில், கோஸ்டாமியர்கள் Z-வட்டை சர்கோலெம்மாவுடன் இணைக்கின்றன மற்றும் விசை பரிமாற்றம் மற்றும் சமிக்ஞையில் ஈடுபட்டுள்ளன. 25 செல்-செல் ஒட்டுதல் (டிரான்ஸ்கிரிப்டோம், படம் 2C) மற்றும் கோஸ்டாமியர் (புரோட்டியம், படம் 2D) அம்சங்களைப் பயன்படுத்தி குறிப்பிடப்பட்ட PCA வரைபடங்கள் PC1 இல் வலுவான இடது மாற்றத்தை வெளிப்படுத்தின, இந்த அம்சங்கள் சில இழைகளில் செறிவூட்டப்பட்டுள்ளன என்பதைக் குறிக்கிறது.
UMAP மட்டத்தில் மயோஃபைபர் கிளஸ்டரிங்கின் விரிவான பரிசோதனையில், பெரும்பாலான அம்சங்கள் மயோஃபைபர் துணைக் கிளஸ்டர்-குறிப்பிட்டதை விட மயோஃபைபர் வகை-சார்பற்ற MYH-அடிப்படையிலான வெளிப்பாடு சாய்வைக் காட்டியது தெரியவந்தது. CHCHD10 (நரம்புத்தசை நோய்), SLIT3 (தசைச் சிதைவு), CTDNEP1 (தசை நோய்) போன்ற நோயியல் நிலைமைகளுடன் தொடர்புடைய பல மரபணுக்களுக்கு (படம் 2E) இந்தத் தொடர்ச்சி காணப்பட்டது. நரம்பியல் கோளாறுகள் (UGDH), இன்சுலின் சிக்னலிங் (PHIP) மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் (HIST1H2AB) (படம் 2F) ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடைய புரதங்கள் உட்பட, புரோட்டியோம் முழுவதும் இந்தத் தொடர்ச்சி காணப்பட்டது. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்தத் தரவுகள் வெவ்வேறு மயோஃபைபர்களில் ஃபைபர் வகை-சார்பற்ற மெதுவான/வேகமான இழுப்பு பன்முகத்தன்மையில் தொடர்ச்சியைக் குறிக்கின்றன.
சுவாரஸ்யமாக, PC2 இல் உள்ள இயக்கி மரபணுக்கள் நல்ல டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்-புரோட்டியம் தொடர்புகளைக் காட்டின (r = 0.663) (படம் 2G), மெதுவான மற்றும் வேகமான இழுப்பு இழை வகைகள், குறிப்பாக எலும்பு தசை நார்களின் சுருக்க மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற பண்புகள், டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் முறையில் கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், PC1 இல் உள்ள இயக்கி மரபணுக்கள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்-புரோட்டியம் தொடர்பைக் காட்டவில்லை (r = -0.027) (படம் 2H), மெதுவான/வேகமான இழுப்பு இழை வகைகளுடன் தொடர்பில்லாத மாறுபாடுகள் பெரும்பாலும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனலுக்குப் பிறகு கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது. PC1 இல் உள்ள மாறுபாடுகள் முதன்மையாக ரைபோசோமால் மரபணு ஆன்டாலஜி சொற்களால் விளக்கப்பட்டன, மேலும் புரத மொழிபெயர்ப்பில் தீவிரமாக பங்கேற்று செல்வாக்கு செலுத்துவதன் மூலம் ரைபோசோம்கள் செல்லில் ஒரு முக்கியமான மற்றும் சிறப்புப் பங்கை வகிக்கின்றன என்பதைக் கருத்தில் கொண்டு, 31 இந்த எதிர்பாராத ரைபோசோமால் பன்முகத்தன்மையை ஆராய நாங்கள் அடுத்ததாக புறப்பட்டோம்.
"சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரைபோசோம்" (படம் 3A) என்ற GOCC வார்த்தையில் உள்ள புரதங்களின் ஒப்பீட்டு மிகுதியின் படி புரோட்டியோமிக்ஸ் முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு சதித்திட்டத்தை முதலில் வண்ணமயமாக்கினோம். இந்த சொல் PC1 இன் நேர்மறை பக்கத்தில் செறிவூட்டப்பட்டிருந்தாலும், ஒரு சிறிய சாய்வுக்கு வழிவகுத்தாலும், ரைபோசோமால் புரதங்கள் PC1 இன் இரு திசைகளிலும் பகிர்வை இயக்குகின்றன (படம் 3A). PC1 இன் எதிர்மறை பக்கத்தில் செறிவூட்டப்பட்ட ரைபோசோமால் புரதங்களில் RPL18, RPS18 மற்றும் RPS13 (படம் 3B) ஆகியவை அடங்கும், அதே நேரத்தில் RPL31, RPL35 மற்றும் RPL38 (படம் 3C) ஆகியவை PC1 இன் நேர்மறை பக்கத்தில் முக்கிய இயக்கிகளாக இருந்தன. சுவாரஸ்யமாக, RPL38 மற்றும் RPS13 மற்ற திசுக்களுடன் ஒப்பிடும்போது எலும்பு தசையில் அதிகமாக வெளிப்படுத்தப்பட்டன (துணை படம் 7A). PC1 இல் உள்ள இந்த தனித்துவமான ரைபோசோமால் கையொப்பங்கள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் காணப்படவில்லை (துணை படம் 7B), இது பிந்தைய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையைக் குறிக்கிறது.
A. புரோட்டியோம் முழுவதும் சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரைபோசோமால் மரபணு ஆன்டாலஜி (GO) சொற்களின்படி முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) வரைபடம் வண்ணமயமாக்கப்பட்டுள்ளது. அம்புக்குறிகள் PCA வரைபடத்தில் புரத-மத்தியஸ்த மாறுபாட்டின் திசையைக் குறிக்கின்றன. கோட்டின் நீளம் கொடுக்கப்பட்ட புரதத்திற்கான முதன்மை கூறு மதிப்பெண்ணுடன் ஒத்திருக்கிறது. B, C. RPS13 மற்றும் RPL38 க்கான PCA அம்ச வரைபடங்கள். D. சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரைபோசோமால் புரதங்களின் மேற்பார்வை செய்யப்படாத படிநிலை கிளஸ்டரிங் பகுப்பாய்வு. E. எலும்புக்கூடு தசை நார்களில் வெவ்வேறு மிகுதியுடன் ரைபோசோமால் புரதங்களை முன்னிலைப்படுத்தும் 80S ரைபோசோமின் கட்டமைப்பு மாதிரி (PDB: 4V6X). F. mRNA வெளியேறும் சேனலுக்கு அருகில் உள்ளூர்மயமாக்கப்பட்ட வெவ்வேறு ஸ்டோச்சியோமெட்ரி கொண்ட ரைபோசோமால் புரதங்கள்.
ரைபோசோமால் பன்முகத்தன்மை மற்றும் சிறப்புத்தன்மை பற்றிய கருத்துக்கள் முன்னர் முன்மொழியப்பட்டுள்ளன, இதன் மூலம் தனித்துவமான ரைபோசோமால் துணை மக்கள்தொகைகளின் இருப்பு (ரைபோசோமால் பன்முகத்தன்மை) வெவ்வேறு திசுக்களில் புரத மொழிபெயர்ப்பை நேரடியாக பாதிக்கலாம்32 மற்றும் செல்கள்33 குறிப்பிட்ட mRNA டிரான்ஸ்கிரிப்ட் குளங்களின் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மொழிபெயர்ப்பின் மூலம்34 (ரைபோசோமால் சிறப்புத்தன்மை). எலும்புக்கூடு தசை நார்களில் இணைந்து வெளிப்படுத்தப்படும் ரைபோசோமால் புரதங்களின் துணை மக்கள்தொகைகளை அடையாளம் காண, புரோட்டியோமில் உள்ள ரைபோசோமால் புரதங்களின் மேற்பார்வை செய்யப்படாத படிநிலை கிளஸ்டரிங் பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்தோம் (படம் 3D, துணை தரவு தொகுப்பு 8). எதிர்பார்த்தபடி, ரைபோசோமால் புரதங்கள் MYH ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட ஃபைபர் வகையால் கொத்தாகவில்லை. இருப்பினும், ரைபோசோமால் புரதங்களின் மூன்று தனித்துவமான கொத்துகளை நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம்; முதல் கொத்து (ரைபோசோமால்_கிளஸ்டர்_1) RPL38 உடன் இணைந்து ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டுள்ளது, எனவே நேர்மறை PC1 சுயவிவரத்துடன் கூடிய இழைகளில் வெளிப்பாடு அதிகரித்துள்ளது. இரண்டாவது கொத்து (ரைபோசோமால்_கிளஸ்டர்_2) RPS13 உடன் இணைந்து ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டுள்ளது மற்றும் எதிர்மறை PC1 சுயவிவரத்துடன் கூடிய இழைகளில் உயர்த்தப்பட்டுள்ளது. மூன்றாவது கொத்து (ரைபோசோமால்_கிளஸ்டர்_3) எலும்பு தசை நார்களில் ஒருங்கிணைந்த வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டைக் காட்டாது, மேலும் இது "மைய" எலும்பு தசை ரைபோசோமால் புரதமாகக் கருதப்படலாம். ரைபோசோமால் கிளஸ்டர்கள் 1 மற்றும் 2 இரண்டும் மாற்று மொழிபெயர்ப்பை ஒழுங்குபடுத்துவதாக முன்னர் காட்டப்பட்ட ரைபோசோமால் புரதங்களைக் கொண்டுள்ளன (எ.கா., RPL10A, RPL38, RPS19, மற்றும் RPS25) மற்றும் செயல்பாட்டு ரீதியாக வளர்ச்சியை பாதிக்கின்றன (எ.கா., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA முடிவுகளுக்கு இணங்க, இழைகள் முழுவதும் இந்த ரைபோசோமால் புரதங்களின் கவனிக்கப்பட்ட பன்முகத்தன்மை பிரதிநிதித்துவமும் தொடர்ச்சியைக் காட்டியது (துணை படம் 7C).
ரைபோசோமுக்குள் பன்முகத்தன்மை கொண்ட ரைபோசோமால் புரதங்களின் இருப்பிடத்தைக் காட்சிப்படுத்த, மனித 80S ரைபோசோமின் கட்டமைப்பு மாதிரியைப் பயன்படுத்தினோம் (புரத தரவு வங்கி: 4V6X) (படம் 3E). வெவ்வேறு ரைபோசோமால் கிளஸ்டர்களைச் சேர்ந்த ரைபோசோமால் புரதங்களை தனிமைப்படுத்திய பிறகு, அவற்றின் இருப்பிடங்கள் நெருக்கமாக சீரமைக்கப்படவில்லை, இது ரைபோசோமின் சில பகுதிகள்/பின்னங்களுக்கு செறிவூட்டலை வழங்க எங்கள் அணுகுமுறை தோல்வியடைந்ததைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், சுவாரஸ்யமாக, கொத்து 2 இல் பெரிய துணை அலகு புரதங்களின் விகிதம் கொத்துகள் 1 மற்றும் 3 ஐ விட குறைவாக இருந்தது (துணை படம் 7D). எலும்பு தசை நார்களில் மாற்றப்பட்ட ஸ்டோச்சியோமெட்ரி கொண்ட புரதங்கள் முக்கியமாக ரைபோசோம் மேற்பரப்பில் (படம் 3E) உள்ளூர்மயமாக்கப்பட்டிருப்பதைக் கவனித்தோம், இது வெவ்வேறு mRNA மக்கள்தொகைகளில் உள்ள உள் ரைபோசோம் நுழைவு தளம் (IRES) கூறுகளுடன் தொடர்பு கொள்ளும் திறனுடன் ஒத்துப்போகிறது, இதன் மூலம் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மொழிபெயர்ப்பை ஒருங்கிணைக்கிறது. 40, 41 மேலும், எலும்பு தசை நார்களில் மாற்றப்பட்ட ஸ்டோச்சியோமெட்ரி கொண்ட பல புரதங்கள் mRNA வெளியேறும் சுரங்கப்பாதை (படம் 3F) போன்ற செயல்பாட்டு பகுதிகளுக்கு அருகில் அமைந்திருந்தன, அவை மொழிபெயர்ப்பு நீட்டிப்பு மற்றும் குறிப்பிட்ட பெப்டைட்களின் கைது ஆகியவற்றைத் தேர்ந்தெடுத்து ஒழுங்குபடுத்துகின்றன. 42 சுருக்கமாக, எலும்பு தசை ரைபோசோமால் புரதங்களின் ஸ்டோச்சியோமெட்ரி பன்முகத்தன்மையை வெளிப்படுத்துகிறது, இதன் விளைவாக எலும்பு தசை நார்களுக்கு இடையில் வேறுபாடுகள் ஏற்படுகின்றன என்று எங்கள் தரவு தெரிவிக்கிறது.
அடுத்து, வேகமான மற்றும் மெதுவான இழுப்பு இழை கையொப்பங்களை அடையாளம் காணவும், அவற்றின் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையின் வழிமுறைகளை ஆராயவும் நாங்கள் புறப்பட்டோம். இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளில் (படங்கள் 1G–H மற்றும் 4A–B) UMAP ஆல் வரையறுக்கப்பட்ட வேகமான மற்றும் மெதுவான இழுப்பு இழை கிளஸ்டர்களை ஒப்பிட்டு, டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வுகள் முறையே 1366 மற்றும் 804 வேறுபட்ட ஏராளமான அம்சங்களை அடையாளம் கண்டன (படங்கள் 4A–B, துணை தரவுத்தொகுப்புகள் 9–12). சர்கோமியர்கள் (எ.கா., ட்ரோபோமயோசின் மற்றும் ட்ரோபோனின்), தூண்டுதல்-சுருக்க இணைப்பு (SERCA ஐசோஃபார்ம்கள்) மற்றும் ஆற்றல் வளர்சிதை மாற்றம் (எ.கா., ALDOA மற்றும் CKB) தொடர்பான கையொப்பங்களில் எதிர்பார்க்கப்படும் வேறுபாடுகளை நாங்கள் கவனித்தோம். மேலும், புரதம் எங்கும் பரவுவதை ஒழுங்குபடுத்தும் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் புரதங்கள் வேகமான மற்றும் மெதுவான இழுப்பு இழைகளில் (எ.கா., USP54, SH3RF2, USP28, மற்றும் USP48) வித்தியாசமாக வெளிப்படுத்தப்பட்டன (படங்கள் 4A–B). மேலும், முன்னர் ஆட்டுக்குட்டி தசை நார் வகைகள்43 முழுவதும் வித்தியாசமாக வெளிப்படுத்தப்படுவதாகவும், இதய தசை44 இல் SERCA செயல்பாட்டை மேம்படுத்துவதாகவும் காட்டப்பட்டுள்ள நுண்ணுயிர் புரத மரபணு RP11-451G4.2 (DWORF), மெதுவான எலும்பு தசை நார்களில் கணிசமாகக் கட்டுப்படுத்தப்பட்டது (படம் 4A). இதேபோல், தனிப்பட்ட இழை மட்டத்தில், வளர்சிதை மாற்றம் தொடர்பான லாக்டேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் ஐசோஃபார்ம்கள் (LDHA மற்றும் LDHB, படம் 4C மற்றும் துணை படம் 8A)45,46 போன்ற அறியப்பட்ட கையொப்பங்களிலும், முன்னர் அறியப்படாத இழை-வகை-குறிப்பிட்ட கையொப்பங்களிலும் (IRX3, USP54, USP28, மற்றும் DPYSL3 போன்றவை) (படம் 4C) குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகள் காணப்பட்டன. டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் தரவுத்தொகுப்புகளுக்கு இடையில் வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட அம்சங்களின் குறிப்பிடத்தக்க ஒன்றுடன் ஒன்று இருந்தது (துணை படம் 8B), அத்துடன் சர்கோமியர் அம்சங்களின் மிகவும் உச்சரிக்கப்படும் வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டால் இயக்கப்படும் மடிப்பு மாற்ற தொடர்பு (துணை படம் 8C). குறிப்பிடத்தக்க வகையில், சில கையொப்பங்கள் (எ.கா. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) புரோட்டியோமிக் மட்டத்தில் மட்டுமே வலுவான பிந்தைய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையைக் காட்டின, மேலும் மெதுவான/வேகமான இழுப்பு ஃபைபர் வகை-குறிப்பிட்ட வெளிப்பாடு சுயவிவரங்களைக் கொண்டிருந்தன (துணை படம் 8C).
A மற்றும் B எரிமலை வரைபடங்கள், படங்கள் 1G–H இல் உள்ள சீரான பன்மடங்கு தோராயமாக்கல் மற்றும் ப்ரொஜெக்ஷன் (UMAP) வரைபடங்களால் அடையாளம் காணப்பட்ட மெதுவான மற்றும் வேகமான கொத்துக்களை ஒப்பிடுகின்றன. வண்ணப் புள்ளிகள் FDR < 0.05 இல் கணிசமாக வேறுபட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் அல்லது புரதங்களைக் குறிக்கின்றன, மேலும் இருண்ட புள்ளிகள் பதிவு மாற்றம் > 1 இல் கணிசமாக வேறுபட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் அல்லது புரதங்களைக் குறிக்கின்றன. பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்யப்பட்ட p மதிப்புகள் (டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ்) அல்லது லிம்மா நேரியல் மாதிரி முறையை அனுபவ பேய்சியன் பகுப்பாய்வோடு பயன்படுத்தி DESeq2 வால்ட் சோதனையைப் பயன்படுத்தி இருவழி புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து பல ஒப்பீடுகளுக்கு (புரோட்டியோமிக்ஸ்) பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்தல் செய்யப்பட்டது. C மெதுவான மற்றும் வேகமான இழைகளுக்கு இடையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்கள் அல்லது புரதங்களின் கையொப்ப வரைபடங்கள். D கணிசமாக வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் புரதங்களின் செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு. இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளிலும் ஒன்றுடன் ஒன்று மதிப்புகள் செறிவூட்டப்படுகின்றன, டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மதிப்புகள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் மட்டுமே செறிவூட்டப்படுகின்றன, மேலும் புரோட்டியோம் மதிப்புகள் புரோட்டியோமில் மட்டுமே செறிவூட்டப்படுகின்றன. பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்யப்பட்ட p-மதிப்புகளுடன் கூடிய கிளஸ்டர்ப்ரோஃபைலர் தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. E. SCENIC-பெறப்பட்ட சீராக்கி விவரக்குறிப்பு மதிப்பெண்கள் மற்றும் ஃபைபர் வகைகளுக்கு இடையிலான வேறுபட்ட mRNA வெளிப்பாடு ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் SCENIC ஆல் அடையாளம் காணப்பட்ட ஃபைபர் வகை-குறிப்பிட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள். F. மெதுவான மற்றும் வேகமான இழைகளுக்கு இடையில் வித்தியாசமாக வெளிப்படுத்தப்படும் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகளின் விவரக்குறிப்பு.
பின்னர் நாங்கள் வேறுபட்ட முறையில் குறிப்பிடப்பட்ட மரபணுக்கள் மற்றும் புரதங்களின் அதிகப்படியான பிரதிநிதித்துவ பகுப்பாய்வைச் செய்தோம் (படம் 4D, துணை தரவு தொகுப்பு 13). இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளுக்கு இடையில் வேறுபட்ட அம்சங்களுக்கான பாதை செறிவூட்டல், கொழுப்பு அமில β-ஆக்ஸிஜனேற்றம் மற்றும் கீட்டோன் வளர்சிதை மாற்ற செயல்முறைகள் (மெதுவான இழைகள்), மயோஃபிலமென்ட்/தசை சுருக்கம் (முறையே வேகமான மற்றும் மெதுவான இழைகள்), மற்றும் கார்போஹைட்ரேட் கேடபாலிக் செயல்முறைகள் (வேகமான இழைகள்) போன்ற எதிர்பார்க்கப்படும் வேறுபாடுகளை வெளிப்படுத்தியது. கிளைகோஜன் வளர்சிதை மாற்றத்தை ஒழுங்குபடுத்துவதாக அறியப்படும் ஒழுங்குமுறை மற்றும் வினையூக்கி பாஸ்பேட்டஸ் துணை அலகுகள் (PPP3CB, PPP1R3D, மற்றும் PPP1R3A) போன்ற அம்சங்களால் இயக்கப்படும் வேகமான இழைகளிலும் செரின்/த்ரோயோனைன் புரத பாஸ்பேட்டஸ் செயல்பாடு அதிகரித்தது (47) (துணை புள்ளிவிவரங்கள் 8D–E). வேகமான இழைகளால் செறிவூட்டப்பட்ட பிற பாதைகளில் புரோட்டியோமில் செயலாக்க (P-) உடல்கள் (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (துணை படம் 8F), பிந்தைய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையில் (48) ஈடுபடக்கூடிய சாத்தியக்கூறுகள், மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி செயல்பாடு (SREBF1, RXRG, RORA) (துணை படம் 8G) ஆகியவை அடங்கும். மெதுவான இழைகள் ஆக்ஸிடோரடக்டேஸ் செயல்பாட்டில் (BDH1, DCXR, TXN2) (துணை படம் 8H), அமைடு பிணைப்பு (CPTP, PFDN2, CRYAB) (துணை படம் 8I), எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் மேட்ரிக்ஸ் (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (துணை படம் 8J), மற்றும் ஏற்பி-லிகண்ட் செயல்பாடு (FNDC5, SPX, NENF) (துணை படம் 8K) ஆகியவற்றில் செறிவூட்டப்பட்டன.
மெதுவான/வேகமான தசை நார் வகை பண்புகளின் அடிப்படையிலான டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறை பற்றிய கூடுதல் நுண்ணறிவைப் பெற, SCENIC49 (துணை தரவு தொகுப்பு 14) ஐப் பயன்படுத்தி டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்தோம். வேகமான மற்றும் மெதுவான தசை நார்களுக்கு இடையில் பல டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள் கணிசமாக செறிவூட்டப்பட்டன (படம் 4E). இதில் முன்னர் வேகமான தசை நார் வளர்ச்சியுடன் இணைக்கப்பட்ட MAFA போன்ற டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள், 50 அத்துடன் தசை நார் வகை-குறிப்பிட்ட மரபணு நிரல்களுடன் முன்னர் தொடர்புபடுத்தப்படாத பல டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள் அடங்கும். இவற்றில், PITX1, EGR1 மற்றும் MYF6 ஆகியவை வேகமான தசை நார்களில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகளாக இருந்தன (படம் 4E). இதற்கு மாறாக, ZSCAN30 மற்றும் EPAS1 (HIF2A என்றும் அழைக்கப்படுகிறது) மெதுவான தசை நார்களில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகளாக இருந்தன (படம் 4E). இதற்கு இணங்க, வேகமான தசை நார்களுக்கு ஒத்த UMAP பகுதியில் MAFA உயர் மட்டங்களில் வெளிப்படுத்தப்பட்டது, அதே நேரத்தில் EPAS1 எதிர் வெளிப்பாடு வடிவத்தைக் கொண்டிருந்தது (படம் 4F).
அறியப்பட்ட புரத-குறியீட்டு மரபணுக்களுக்கு கூடுதலாக, மனித வளர்ச்சி மற்றும் நோயைக் கட்டுப்படுத்துவதில் ஈடுபடக்கூடிய ஏராளமான குறியீட்டு அல்லாத RNA உயிரியல் வகைகள் உள்ளன. 51, 52 டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் தரவுத்தொகுப்புகளில், பல குறியீட்டு அல்லாத RNAக்கள் ஃபைபர் வகை விவரக்குறிப்பைக் காட்டுகின்றன (படம் 5A மற்றும் துணை தரவுத்தொகுப்பு 15), இதில் LINC01405 அடங்கும், இது மெதுவான இழைகளுக்கு மிகவும் குறிப்பிட்டது மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மயோபதி நோயாளிகளிடமிருந்து தசையில் குறைவதாகக் கூறப்படுகிறது. 53 இதற்கு நேர்மாறாக, lnc-ERCC5-5 மரபணுவுடன் (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 தொடர்புடைய RP11-255P5.3, வேகமான இழை வகை விவரக்குறிப்பைக் காட்டுகிறது. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) மற்றும் RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) இரண்டும் எலும்பு தசை தனித்தன்மையை வெளிப்படுத்துகின்றன (துணை புள்ளிவிவரங்கள் 9A–B) மேலும் அவற்றின் 1 Mb மரபணு சுற்றுப்புறத்திற்குள் அறியப்பட்ட சுருக்க மரபணுக்கள் எதுவும் இல்லை, அவை அண்டை சுருக்க மரபணுக்களை ஒழுங்குபடுத்துவதற்குப் பதிலாக ஃபைபர் வகைகளை ஒழுங்குபடுத்துவதில் சிறப்புப் பங்கைக் கொண்டுள்ளன என்பதைக் குறிக்கிறது. முறையே LINC01405 மற்றும் RP11-255P5.3 இன் மெதுவான/வேகமான ஃபைபர் வகை-குறிப்பிட்ட வெளிப்பாடு சுயவிவரங்கள் RNAஸ்கோப்பைப் பயன்படுத்தி உறுதிப்படுத்தப்பட்டன (படங்கள் 5B–C).
A. குறியீட்டு முறையற்ற RNA டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மெதுவான மற்றும் வேகமான இழுப்பு தசை நார்களில் கணிசமாகக் கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன. B. LINC01405 மற்றும் RP11-255P5.3 இன் மெதுவான மற்றும் வேகமான இழுப்பு இழை வகை தனித்தன்மையைக் காட்டும் பிரதிநிதித்துவ RNAஸ்கோப் படங்கள் முறையே. அளவுகோல் பட்டை = 50 μm. C. RNAஸ்கோப் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்ட மயோஃபைபர் வகை-குறிப்பிட்ட குறியீட்டு முறையற்ற RNA வெளிப்பாட்டின் அளவு (n = சுயாதீன நபர்களிடமிருந்து 3 பயாப்ஸிகள், ஒவ்வொரு தனிநபருக்குள் வேகமான மற்றும் மெதுவான தசை நார்களை ஒப்பிடுதல்). இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர்களின் t-சோதனையைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. பெட்டி வரைபடங்கள் சராசரி மற்றும் முதல் மற்றும் மூன்றாவது காலாண்டுகளைக் காட்டுகின்றன, மீசைகள் குறைந்தபட்ச மற்றும் அதிகபட்ச மதிப்புகளைக் குறிக்கின்றன. D. De novo microbial protein identification workflow (BioRender.com உடன் உருவாக்கப்பட்டது). E. நுண்ணுயிர் புரதம் LINC01405_ORF408:17441:17358 குறிப்பாக மெதுவான எலும்பு தசை நார்களில் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது (n=5 சுயாதீன பங்கேற்பாளர்களிடமிருந்து பயாப்ஸிகள், ஒவ்வொரு பங்கேற்பாளரிடமும் வேகமான மற்றும் மெதுவான தசை நார்களை ஒப்பிடுதல்). அனுபவ ரீதியான பேய்சியன் அணுகுமுறையுடன் இணைக்கப்பட்ட லிம் நேரியல் மாதிரி முறையைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து p-மதிப்பு சரிசெய்தலுடன் பல ஒப்பீடுகளுக்கு பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் முறை பயன்படுத்தப்பட்டது. பெட்டி வரைபடங்கள் சராசரி, முதல் மற்றும் மூன்றாவது காலாண்டுகளைக் காட்டுகின்றன, மீசைகள் அதிகபட்ச/குறைந்தபட்ச மதிப்புகளை சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
சமீபத்தில், பல உத்தேச குறியீட்டு அல்லாத டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்யப்பட்ட நுண்ணுயிர் புரதங்களை குறியாக்கம் செய்கின்றன, அவற்றில் சில தசை செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துகின்றன என்று ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன. 44, 55 சாத்தியமான ஃபைபர் வகை விவரக்குறிப்புடன் கூடிய நுண்ணுயிர் புரதங்களை அடையாளம் காண, 1000 ஃபைபர் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் தரவுத்தொகுப்பில் (படம் 5D) காணப்படும் குறியீட்டு அல்லாத டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களின் வரிசைகளைக் கொண்ட தனிப்பயன் FASTA கோப்பைப் பயன்படுத்தி எங்கள் 1000 ஃபைபர் புரோட்டியோம் தரவுத்தொகுப்பைத் தேடினோம். 22 வெவ்வேறு டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களிலிருந்து 197 நுண்ணுயிர் புரதங்களை நாங்கள் கண்டறிந்தோம், அவற்றில் 71 மெதுவான மற்றும் வேகமான எலும்பு தசை நார்களுக்கு இடையில் வித்தியாசமாக ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டன (துணை படம் 9C மற்றும் துணை தரவு தொகுப்பு 16). LINC01405 க்கு, மூன்று நுண்ணுயிர் புரத தயாரிப்புகள் அடையாளம் காணப்பட்டன, அவற்றில் ஒன்று அதன் டிரான்ஸ்கிரிப்ட்டுக்கு ஒத்த மெதுவான ஃபைபர் தனித்துவத்தைக் காட்டியது (படம் 5E மற்றும் துணை படம் 9D). எனவே, மெதுவான எலும்பு தசை நார்களுக்கு குறிப்பிட்ட நுண்ணுயிர் புரதத்தை குறியாக்கம் செய்யும் மரபணுவாக LINC01405 ஐ அடையாளம் கண்டோம்.
தனிப்பட்ட தசை நார்களின் பெரிய அளவிலான புரோட்டியோமிக் குணாதிசயத்திற்கும், ஆரோக்கியமான நிலைகளில் ஃபைபர் பன்முகத்தன்மையின் அடையாளம் காணப்பட்ட கட்டுப்பாட்டாளர்களுக்கும் ஒரு விரிவான பணிப்பாய்வை நாங்கள் உருவாக்கினோம். நெமலின் மயோபதிகள் எலும்பு தசை நார் பன்முகத்தன்மையை எவ்வாறு பாதிக்கின்றன என்பதைப் புரிந்துகொள்ள இந்த பணிப்பாய்வைப் பயன்படுத்தினோம். நெமலின் மயோபதிகள் தசை பலவீனத்தை ஏற்படுத்தும் மரபுவழி தசை நோய்கள் மற்றும் பாதிக்கப்பட்ட குழந்தைகளில், சுவாசக் கோளாறு, ஸ்கோலியோசிஸ் மற்றும் வரையறுக்கப்பட்ட மூட்டு இயக்கம் உள்ளிட்ட பல்வேறு சிக்கல்களைக் கொண்டுள்ளன. 19,20 பொதுவாக, நெமலின் மயோபதிகளில், ஆக்டின் ஆல்பா 1 (ACTA1) போன்ற மரபணுக்களில் உள்ள நோய்க்கிருமி மாறுபாடுகள் மெதுவாக இழுப்பு ஃபைபர் மயோஃபைபர் கலவையின் ஆதிக்கத்தை ஏற்படுத்துகின்றன, இருப்பினும் இந்த விளைவு பன்முகத்தன்மை கொண்டது. ஒரு குறிப்பிடத்தக்க விதிவிலக்கு ட்ரோபோனின் T1 நெமலின் மயோபதி (TNNT1), இது வேகமான இழைகளின் ஆதிக்கத்தைக் கொண்டுள்ளது. எனவே, நெமலின் மயோபதிகளில் காணப்படும் எலும்பு தசை நார் ஒழுங்குமுறைக்கு அடிப்படையான பன்முகத்தன்மையை நன்கு புரிந்துகொள்வது இந்த நோய்களுக்கும் மயோஃபைபர் வகைக்கும் இடையிலான சிக்கலான உறவை அவிழ்க்க உதவும்.
ஆரோக்கியமான கட்டுப்பாடுகளுடன் (ஒரு குழுவிற்கு n=3) ஒப்பிடும்போது, ​​ACTA1 மற்றும் TNNT1 மரபணுக்களில் பிறழ்வுகளைக் கொண்ட நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளிடமிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மயோஃபைபர்கள் குறிப்பிடத்தக்க மயோஃபைபர் அட்ராபி அல்லது டிஸ்ட்ரோபியைக் காட்டின (படம் 6A, துணை அட்டவணை 3). கிடைக்கக்கூடிய பொருட்களின் குறைந்த அளவு காரணமாக இது புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்விற்கு குறிப்பிடத்தக்க தொழில்நுட்ப சவால்களை முன்வைத்தது. இதுபோன்ற போதிலும், 272 எலும்பு மயோஃபைபர்களில் 2485 புரதங்களைக் கண்டறிய முடிந்தது. ஒரு ஃபைபருக்கு குறைந்தது 1000 அளவிடப்பட்ட புரதங்களை வடிகட்டிய பிறகு, 250 இழைகள் அடுத்தடுத்த உயிர் தகவலியல் பகுப்பாய்விற்கு உட்படுத்தப்பட்டன. வடிகட்டிய பிறகு, ஒரு ஃபைபருக்கு சராசரியாக 1573 ± 359 புரதங்கள் அளவிடப்பட்டன (துணை படம் 10A, துணை தரவு தொகுப்புகள் 17–18). குறிப்பாக, ஃபைபர் அளவில் குறிப்பிடத்தக்க குறைப்பு இருந்தபோதிலும், நெமலின் மயோபதி நோயாளி மாதிரிகளின் புரோட்டியோம் ஆழம் மிதமாக மட்டுமே குறைக்கப்பட்டது. மேலும், எங்கள் சொந்த FASTA கோப்புகளைப் பயன்படுத்தி இந்தத் தரவைச் செயலாக்குவது (குறியீடு செய்யப்படாத டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் உட்பட) நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளிடமிருந்து எலும்பு மயோஃபைபர்களில் ஐந்து நுண்ணுயிர் புரதங்களை அடையாளம் காண எங்களுக்கு உதவியது (துணை தரவு தொகுப்பு 19). புரோட்டியோமின் டைனமிக் வரம்பு கணிசமாக பரந்ததாக இருந்தது, மேலும் கட்டுப்பாட்டு குழுவில் உள்ள மொத்த புரதங்கள் முந்தைய 1000-ஃபைபர் புரோட்டியோம் பகுப்பாய்வின் முடிவுகளுடன் (துணை படம் 10B–C) நன்கு தொடர்புடையவை.
A. ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதிகளில் (NM) MYH ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட ஃபைபர் அட்ராபி அல்லது டிஸ்ட்ரோபி மற்றும் வெவ்வேறு ஃபைபர் வகைகளின் ஆதிக்கத்தைக் காட்டும் நுண்ணிய படங்கள். அளவுகோல் = 100 μm. ACTA1 மற்றும் TNNT1 நோயாளிகளில் கறை படிதல் மீண்டும் உருவாக்கப்படுவதை உறுதிசெய்ய, பிரதிநிதித்துவ படங்களைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்கு முன் மூன்று நோயாளி பயாப்ஸிகள் இரண்டு முதல் மூன்று முறை (ஒரு வழக்குக்கு நான்கு பிரிவுகள்) கறை படிந்தன. B. MYH அடிப்படையில் பங்கேற்பாளர்களில் ஃபைபர் வகை விகிதாச்சாரங்கள். C. நெமலின் மயோபதிகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகள் உள்ள நோயாளிகளில் எலும்பு தசை நார்களின் முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) சதி. D. நெமலின் மயோபதிகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகள் உள்ள நோயாளிகளிடமிருந்து எலும்பு தசை நார்கள் படம் 2 இல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட 1000 இழைகளிலிருந்து தீர்மானிக்கப்பட்ட PCA சதித்திட்டத்தில் திட்டமிடப்பட்டுள்ளன. எடுத்துக்காட்டாக, ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதிகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகள் உள்ள பங்கேற்பாளர்களுக்கும் ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதிகள் உள்ள பங்கேற்பாளர்களுக்கும் இடையிலான வேறுபாடுகளை ஒப்பிடும் எரிமலை சதித்திட்டங்கள். வண்ண வட்டங்கள் π < 0.05 இல் கணிசமாக வேறுபட்ட புரதங்களைக் குறிக்கின்றன, மேலும் கருமையான புள்ளிகள் FDR < 0.05 இல் கணிசமாக வேறுபட்ட புரதங்களைக் குறிக்கின்றன. லிம்மா நேரியல் மாதிரி முறை மற்றும் அனுபவ ரீதியான பேய்சியன் முறைகளைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் முறையைப் பயன்படுத்தி பல ஒப்பீடுகளுக்கு p-மதிப்பு சரிசெய்தல் செய்யப்பட்டது. H. முழு புரோட்டியோம் முழுவதும் மற்றும் வகை 1 மற்றும் 2A இழைகளில் கணிசமாக வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட புரதங்களின் செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு. கிளஸ்டர்புரோஃபைலர் தொகுப்பு மற்றும் பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்யப்பட்ட p-மதிப்புகளைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. I, J. முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) அடுக்குகள் புற-செல்லுலார் மேட்ரிக்ஸ் மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணு ஆன்டாலஜி (GO) சொற்களால் வண்ணமயமாக்கப்பட்டன.
நெமலின் மயோபதிகள் எலும்புத் தசையில் MYH-வெளிப்படுத்தும் மயோஃபைபர் வகைகளின் விகிதத்தை பாதிக்கக்கூடும் என்பதால், 19,20 நெமலின் மயோபதிகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகள் உள்ள நோயாளிகளில் MYH-வெளிப்படுத்தும் மயோஃபைபர் வகைகளை முதலில் ஆய்வு செய்தோம். 1000 மயோஃபைபர் மதிப்பீட்டிற்கு (துணை படம். 10D–E) முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட ஒரு சார்பற்ற முறையைப் பயன்படுத்தி மயோஃபைபர் வகையை நாங்கள் தீர்மானித்தோம், மேலும் மீண்டும் தூய 2X மயோஃபைபர்களை அடையாளம் காணத் தவறிவிட்டோம் (படம் 6B). ACTA1 பிறழ்வுகளைக் கொண்ட இரண்டு நோயாளிகள் வகை 1 மயோஃபைபர்களின் அதிகரித்த விகிதத்தைக் கொண்டிருந்ததால், TNNT1 நெமலின் மயோபதி உள்ள இரண்டு நோயாளிகள் வகை 1 மயோஃபைபர்களின் விகிதத்தைக் குறைத்ததால், மயோஃபைபர் வகையின் மீது நெமலின் மயோபதிகளின் பன்முக விளைவைக் கண்டோம் (படம் 6B). உண்மையில், ACTA1-நெமலின் மயோபதிகளில் MYH2 மற்றும் வேகமான ட்ரோபோனின் ஐசோஃபார்ம்களின் (TNNC2, TNNI2, மற்றும் TNNT3) வெளிப்பாடு குறைந்தது, அதேசமயம் TNNT1-நெமலின் மயோபதிகளில் MYH7 வெளிப்பாடு குறைந்தது (துணை படம் 11A). நெமலின் மயோபதிகளில் பன்முகத்தன்மை கொண்ட மயோஃபைபர் வகை மாறுதல் பற்றிய முந்தைய அறிக்கைகளுடன் இது ஒத்துப்போகிறது.19,20 இந்த முடிவுகளை இம்யூனோஹிஸ்டோ கெமிஸ்ட்ரி மூலம் நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம், மேலும் ACTA1-நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளுக்கு வகை 1 மயோஃபைபர்கள் அதிகமாக இருப்பதைக் கண்டறிந்தோம், அதேசமயம் TNNT1-நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளுக்கு எதிர் வடிவம் இருந்தது (படம் 6A).
ஒற்றை-ஃபைபர் புரோட்டியோம் மட்டத்தில், ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளின் எலும்பு தசை நார்கள் பெரும்பாலான கட்டுப்பாட்டு இழைகளுடன் கொத்தாக உள்ளன, TNNT1 நெமலின் மயோபதி இழைகள் பொதுவாக மிகவும் கடுமையாகப் பாதிக்கப்படுகின்றன (படம் 6C). ஒவ்வொரு நோயாளிக்கும் போலி-ஊதப்பட்ட இழைகளின் முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) அடுக்குகளைத் திட்டமிடும்போது இது குறிப்பாகத் தெளிவாகத் தெரிந்தது, TNNT1 நெமலின் மயோபதி நோயாளிகள் 2 மற்றும் 3 கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகளிலிருந்து மிகத் தொலைவில் தோன்றினர் (துணை படம் 11B, துணைத் தரவு தொகுப்பு 20). மயோபதி நோயாளிகளின் இழைகள் ஆரோக்கியமான இழைகளுடன் எவ்வாறு ஒப்பிடுகின்றன என்பதை நன்கு புரிந்துகொள்ள, ஆரோக்கியமான வயதுவந்த பங்கேற்பாளர்களிடமிருந்து 1,000 இழைகளின் புரோட்டியோம் பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட விரிவான தகவல்களைப் பயன்படுத்தினோம். மயோபதி தரவுத்தொகுப்பிலிருந்து (ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதி நோயாளிகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகள்) இழைகளை 1000-ஃபைபர் புரோட்டியோம் பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட PCA அடுக்குக்கு நாங்கள் கணித்தோம் (படம் 6D). கட்டுப்பாட்டு இழைகளில் PC2 உடன் MYH ஃபைபர் வகைகளின் பரவல் 1000-ஃபைபர் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட ஃபைபர் விநியோகத்தைப் போலவே இருந்தது. இருப்பினும், நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளில் பெரும்பாலான இழைகள் PC2 ஐக் கீழே நகர்த்தின, அவற்றின் சொந்த MYH ஃபைபர் வகையைப் பொருட்படுத்தாமல், ஆரோக்கியமான வேகமான இழுப்பு இழைகளுடன் ஒன்றுடன் ஒன்று சேர்ந்தன. இதனால், ACTA1 நெமலின் மயோபதி நோயாளிகள் MYH- அடிப்படையிலான முறைகளைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டபோது வகை 1 இழைகளை நோக்கி மாற்றத்தைக் காட்டினாலும், ACTA1 நெமலின் மயோபதி மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதி இரண்டும் எலும்பு தசை நார் புரோட்டியோமை வேகமாக இழுப்பு இழைகளை நோக்கி மாற்றின.
பின்னர் நாங்கள் ஒவ்வொரு நோயாளி குழுவையும் ஆரோக்கியமான கட்டுப்பாடுகளுடன் நேரடியாக ஒப்பிட்டு, ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதிகளில் முறையே 256 மற்றும் 552 வித்தியாசமாக வெளிப்படுத்தப்பட்ட புரதங்களை அடையாளம் கண்டோம் (படம் 6E–G மற்றும் துணை படம் 11C, துணை தரவு தொகுப்பு 21). மரபணு செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதங்களில் ஒருங்கிணைந்த குறைவை வெளிப்படுத்தியது (படம் 6H–I, துணை தரவு தொகுப்பு 22). ஆச்சரியப்படும் விதமாக, ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதிகளில் ஃபைபர் வகைகளின் வேறுபட்ட ஆதிக்கம் இருந்தபோதிலும், இந்த குறைவு MYH- அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகையிலிருந்து முற்றிலும் சுயாதீனமாக இருந்தது (படம் 6H மற்றும் துணை புள்ளிவிவரங்கள் 11D–I, துணை தரவு தொகுப்பு 23). ACTA1 அல்லது TNNT1 நெமலின் மயோபதிகளில் மூன்று நுண்ணுயிர் புரதங்களும் கட்டுப்படுத்தப்பட்டன. இந்த நுண் புரதங்களில் இரண்டு, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 அல்லது Lnc-FOXO1 என்றும் அழைக்கப்படுகிறது) மற்றும் ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), வகை 1 மயோஃபைபர்களில் மட்டுமே வேறுபட்ட மிகுதியைக் காட்டின. ENSG00000215483_TR14_ORF67 செல் சுழற்சி ஒழுங்குமுறையில் பங்கு வகிப்பதாக முன்னர் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது. 56 மறுபுறம், ஆரோக்கியமான கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது ACTA1-நெமலின் மயோபதியில் வகை 1 மற்றும் வகை 2A மயோஃபைபர்கள் இரண்டிலும் ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 உடன் தொடர்புடையது) அதிகரித்துள்ளது (துணை படம் 12A, துணை தரவு தொகுப்பு 24). இதற்கு நேர்மாறாக, ரைபோசோமால் புரதங்கள் நெமலின் மயோபதியால் பெரிதும் பாதிக்கப்படவில்லை, இருப்பினும் ACTA1 நெமலின் மயோபதியில் RPS17 குறைவாகக் கட்டுப்படுத்தப்பட்டது (படம் 6E).
செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதிகளில் நோயெதிர்ப்பு அமைப்பு செயல்முறைகளின் மேல் ஒழுங்குமுறையையும் வெளிப்படுத்தியது, அதே நேரத்தில் TNNT1 நெமலின் மயோபதியிலும் செல் ஒட்டுதல் அதிகரித்தது (படம் 6H). இந்த புற-செல்லுலார் காரணிகளின் செறிவூட்டல், புற-செல்லுலார் மேட்ரிக்ஸ் புரதங்கள் PC1 மற்றும் PC2 இல் PCA ஐ எதிர்மறையான திசையில் (அதாவது, மிகவும் பாதிக்கப்பட்ட இழைகளை நோக்கி) மாற்றுவதன் மூலம் பிரதிபலித்தது (படம் 6J). இரண்டு நோயாளி குழுக்களும் நோயெதிர்ப்பு மறுமொழிகள் மற்றும் சார்கோலெமல் பழுதுபார்க்கும் வழிமுறைகளில் ஈடுபட்டுள்ள புற-செல்லுலார் புரதங்களின் அதிகரித்த வெளிப்பாட்டைக் காட்டின, அதாவது அனெக்சின்கள் (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 மற்றும் அவற்றின் ஊடாடும் புரதம் S100A1159 (துணை புள்ளிவிவரங்கள் 12B–C). இந்த செயல்முறை தசைநார் சிதைவுகளில் மேம்படுத்தப்படுவதாக முன்னர் தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது60 ஆனால், எங்களுக்குத் தெரிந்தவரை, இதற்கு முன்னர் நெமலின் மயோபதிகளுடன் தொடர்புடையதாக இல்லை. காயத்திற்குப் பிறகு சர்கோலெமல் பழுதுபார்ப்புக்கும், புதிதாக உருவாக்கப்பட்ட மயோசைட்டுகளை மயோஃபைபர்களுடன் இணைப்பதற்கும் இந்த மூலக்கூறு இயந்திரத்தின் இயல்பான செயல்பாடு தேவைப்படுகிறது58,61. இதனால், இரு நோயாளி குழுக்களிலும் இந்த செயல்முறையின் அதிகரித்த செயல்பாடு, மயோஃபைபர் உறுதியற்ற தன்மையால் ஏற்படும் காயத்திற்கு ஈடுசெய்யும் பதிலைக் குறிக்கிறது.
ஒவ்வொரு நெமலின் மயோபதியின் விளைவுகளும் நன்கு தொடர்புடையவை (r = 0.736) மற்றும் நியாயமான ஒன்றுடன் ஒன்று இருப்பதைக் காட்டின (துணை படங்கள் 11A–B), ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதி ஆகியவை புரோட்டியோம் மீது ஒத்த விளைவுகளைக் கொண்டுள்ளன என்பதைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், சில புரதங்கள் ACTA1 அல்லது TNNT1 நெமலின் மயோபதியில் மட்டுமே கட்டுப்படுத்தப்பட்டன (துணை படங்கள் 11A மற்றும் C). புரோஃபைப்ரோடிக் புரதம் MFAP4 TNNT1 நெமலின் மயோபதியில் மிகவும் ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட புரதங்களில் ஒன்றாகும், ஆனால் ACTA1 நெமலின் மயோபதியில் மாறாமல் இருந்தது. HOX மரபணு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை ஒழுங்குபடுத்துவதற்குப் பொறுப்பான PAF1C வளாகத்தின் ஒரு அங்கமான SKIC8, TNNT1 நெமலின் மயோபதியில் குறைக்கப்பட்டது, ஆனால் ACTA1 நெமலின் மயோபதியில் பாதிக்கப்படவில்லை (துணை படம் 11A). ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதியின் நேரடி ஒப்பீடு, TNNT1 நெமலின் மயோபதியில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதங்களில் அதிக குறைப்புகளையும் நோயெதிர்ப்பு அமைப்பு புரதங்களில் அதிகரிப்பையும் வெளிப்படுத்தியது (படம் 6G–H மற்றும் துணை புள்ளிவிவரங்கள் 11C மற்றும் 11H–I). இந்தத் தரவுகள் TNNT1 நெமலின் மயோபதியுடன் ஒப்பிடும்போது TNNT1 நெமலின் மயோபதியில் காணப்பட்ட அதிக அட்ராபி/டிஸ்ட்ரோபியுடன் ஒத்துப்போகின்றன (படம் 6A), இது TNNT1 நெமலின் மயோபதி நோயின் மிகவும் கடுமையான வடிவத்தைக் குறிக்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.
நெமலின் மயோபதியின் கவனிக்கப்பட்ட விளைவுகள் முழு தசை மட்டத்திலும் நீடிக்கிறதா என்பதை மதிப்பிடுவதற்கு, TNNT1 நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளின் அதே குழுவிலிருந்து தசை பயாப்ஸிகளின் மொத்த புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்து, அவற்றை கட்டுப்பாடுகளுடன் (ஒரு குழுவிற்கு n=3) ஒப்பிட்டோம் (துணை படம் 13A, துணை தரவு தொகுப்பு 25). எதிர்பார்த்தபடி, முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வில் கட்டுப்பாடுகள் நெருக்கமாக தொடர்புடையவை, அதே நேரத்தில் TNNT1 நெமலின் மயோபதி நோயாளிகள் ஒற்றை இழை பகுப்பாய்வில் காணப்பட்டதைப் போன்ற அதிக இடை மாதிரி மாறுபாட்டைக் காட்டினர் (துணை படம் 13B). மொத்த பகுப்பாய்வு, தனிப்பட்ட இழைகளை ஒப்பிடுவதன் மூலம் சிறப்பிக்கப்பட்ட வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட புரதங்களை (துணை படம் 13C, துணை தரவு தொகுப்பு 26) மற்றும் உயிரியல் செயல்முறைகளை (துணை படம் 13D, துணை தரவு தொகுப்பு 27) மீண்டும் உருவாக்கியது, ஆனால் வெவ்வேறு இழை வகைகளுக்கு இடையில் வேறுபடுத்தி அறியும் திறனை இழந்தது மற்றும் இழைகள் முழுவதும் பன்முகத்தன்மை கொண்ட நோய் விளைவுகளைக் கணக்கிடத் தவறிவிட்டது.
ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், ஒற்றை-மயோஃபைபர் புரோட்டியோமிக்ஸ், இம்யூனோபிளாட்டிங் போன்ற இலக்கு முறைகளால் கண்டறிய முடியாத மருத்துவ உயிரியல் அம்சங்களை தெளிவுபடுத்த முடியும் என்பதை இந்த தரவுகள் நிரூபிக்கின்றன. மேலும், பினோடைபிக் தழுவலை விவரிக்க ஆக்டின் ஃபைபர் டைப்பிங்கை (MYH) மட்டும் பயன்படுத்துவதன் வரம்புகளை இந்த தரவு எடுத்துக்காட்டுகிறது. உண்மையில், ஃபைபர் வகை மாறுதல் ஆக்டின் மற்றும் ட்ரோபோனின் நெமலின் மயோபதிகளுக்கு இடையில் வேறுபட்டாலும், இரண்டு நெமலின் மயோபதிகளும் எலும்பு தசை நார் வளர்சிதை மாற்றத்திலிருந்து MYH ஃபைபர் டைப்பிங்கை வேகமான மற்றும் குறைவான ஆக்ஸிஜனேற்ற தசை புரோட்டியோமை நோக்கி துண்டிக்கின்றன.
திசுக்கள் அவற்றின் பல்வேறு தேவைகளைப் பூர்த்தி செய்வதற்கு செல்லுலார் பன்முகத்தன்மை மிகவும் முக்கியமானது. எலும்பு தசையில், இது பெரும்பாலும் வெவ்வேறு அளவிலான சக்தி உற்பத்தி மற்றும் சோர்வுத்தன்மையால் வகைப்படுத்தப்படும் ஃபைபர் வகைகளாக விவரிக்கப்படுகிறது. இருப்பினும், இது எலும்பு தசை நார் மாறுபாட்டின் ஒரு சிறிய பகுதியை மட்டுமே விளக்குகிறது என்பது தெளிவாகிறது, இது முன்னர் நினைத்ததை விட மிகவும் மாறுபடும், சிக்கலானது மற்றும் பன்முகத்தன்மை கொண்டது. தொழில்நுட்ப முன்னேற்றங்கள் இப்போது எலும்பு தசை நார்களை ஒழுங்குபடுத்தும் காரணிகளை வெளிச்சம் போட்டுக் காட்டியுள்ளன. உண்மையில், வகை 2X இழைகள் ஒரு தனித்துவமான எலும்பு தசை நார் துணை வகையாக இருக்காது என்று எங்கள் தரவு தெரிவிக்கிறது. மேலும், எலும்பு தசை நார் பன்முகத்தன்மையின் முக்கிய தீர்மானிப்பாளர்களாக வளர்சிதை மாற்ற புரதங்கள், ரைபோசோமால் புரதங்கள் மற்றும் செல்-தொடர்புடைய புரதங்களை நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம். நெமடோட் மயோபதியுடன் கூடிய நோயாளி மாதிரிகளுக்கு எங்கள் புரோட்டியோமிக் பணிப்பாய்வைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், MYH- அடிப்படையிலான ஃபைபர் தட்டச்சு எலும்பு தசை பன்முகத்தன்மையை முழுமையாக பிரதிபலிக்காது என்பதை நாங்கள் மேலும் நிரூபித்தோம், குறிப்பாக அமைப்பு குழப்பத்தில் இருக்கும்போது. உண்மையில், MYH- அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகையைப் பொருட்படுத்தாமல், நெமடோட் மயோபதி வேகமான மற்றும் குறைவான ஆக்ஸிஜனேற்ற இழைகளை நோக்கி மாற்றத்தை ஏற்படுத்துகிறது.
19 ஆம் நூற்றாண்டிலிருந்து எலும்பு தசை நார்கள் வகைப்படுத்தப்பட்டுள்ளன. சமீபத்திய ஓமிக்ஸ் பகுப்பாய்வுகள், வெவ்வேறு MYH ஃபைபர் வகைகளின் வெளிப்பாடு சுயவிவரங்களையும், வெவ்வேறு தூண்டுதல்களுக்கு அவற்றின் பதில்களையும் புரிந்துகொள்ளத் தொடங்க அனுமதித்துள்ளன. இங்கே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, எலும்பு தசை நார் வகையை வரையறுக்க ஒற்றை (அல்லது ஒரு சில) குறிப்பான்களின் அளவீட்டை நம்பாமல், பாரம்பரிய ஆன்டிபாடி அடிப்படையிலான முறைகளை விட ஃபைபர் வகை குறிப்பான்களை அளவிடுவதற்கு ஓமிக்ஸ் அணுகுமுறைகள் அதிக உணர்திறனின் நன்மையையும் கொண்டுள்ளன. மனித எலும்பு தசை நார்களில் ஃபைபர் பன்முகத்தன்மையின் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் மற்றும் பிந்தைய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ஒழுங்குமுறையை ஆராய நாங்கள் நிரப்பு டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பணிப்பாய்வுகளைப் பயன்படுத்தினோம் மற்றும் முடிவுகளை ஒருங்கிணைத்தோம். இந்த பணிப்பாய்வு எங்கள் ஆரோக்கியமான இளைஞர்களின் குழுவின் வாஸ்டஸ் லேட்டரலிஸில் புரத மட்டத்தில் தூய 2X-வகை இழைகளை அடையாளம் காணத் தவறிவிட்டது. இது முந்தைய ஒற்றை ஃபைபர் ஆய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது, இது ஆரோக்கியமான வாஸ்டஸ் லேட்டரலிஸில் <1% தூய 2X இழைகளைக் கண்டறிந்தது, இருப்பினும் இது எதிர்காலத்தில் மற்ற தசைகளில் உறுதிப்படுத்தப்பட வேண்டும். mRNA மட்டத்தில் கிட்டத்தட்ட தூய 2X இழைகளைக் கண்டறிவதற்கும் புரத மட்டத்தில் கலப்பு 2A/2X இழைகளை மட்டும் கண்டறிவதற்கும் இடையிலான முரண்பாடு குழப்பத்தை ஏற்படுத்துகிறது. MYH ஐசோஃபார்ம் mRNA வெளிப்பாடு சர்க்காடியன் அல்ல,67 RNA மட்டத்தில் வெளித்தோற்றத்தில் தூய 2X இழைகளில் MYH2 தொடக்க சமிக்ஞையை நாம் "தவறவிட்டிருக்க" வாய்ப்பில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. ஒரு சாத்தியமான விளக்கம், முற்றிலும் அனுமானமாக இருந்தாலும், MYH ஐசோஃபார்ம்களுக்கு இடையிலான புரதம் மற்றும்/அல்லது mRNA நிலைத்தன்மையில் உள்ள வேறுபாடுகளாக இருக்கலாம். உண்மையில், எந்த வேகமான இழையும் எந்த MYH ஐசோஃபார்முக்கும் 100% தூய்மையானது அல்ல, மேலும் 70-90% வரம்பில் உள்ள MYH1 mRNA வெளிப்பாடு அளவுகள் புரத மட்டத்தில் சமமான MYH1 மற்றும் MYH2 மிகுதியை விளைவிக்குமா என்பது தெளிவாகத் தெரியவில்லை. இருப்பினும், முழு டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் அல்லது புரோட்டியோமையும் கருத்தில் கொள்ளும்போது, ​​கிளஸ்டர் பகுப்பாய்வு அவற்றின் துல்லியமான MYH கலவையைப் பொருட்படுத்தாமல், மெதுவான மற்றும் வேகமான எலும்பு தசை நார்களைக் குறிக்கும் இரண்டு தனித்துவமான கிளஸ்டர்களை மட்டுமே நம்பிக்கையுடன் அடையாளம் காண முடியும். இது ஒற்றை-நியூக்ளியஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் அணுகுமுறைகளைப் பயன்படுத்தும் பகுப்பாய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது, இது பொதுவாக இரண்டு தனித்துவமான மயோநியூக்ளியர் கிளஸ்டர்களை மட்டுமே அடையாளம் காட்டுகிறது. 68, 69, 70 மேலும், முந்தைய புரோட்டியோமிக் ஆய்வுகள் வகை 2X இழைகளை அடையாளம் கண்டிருந்தாலும், இந்த இழைகள் மீதமுள்ள வேகமான இழைகளிலிருந்து தனித்தனியாகக் கொத்தாக இல்லை மற்றும் MYH ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட பிற இழை வகைகளுடன் ஒப்பிடும்போது குறைந்த எண்ணிக்கையிலான வேறுபட்ட ஏராளமான புரதங்களை மட்டுமே காட்டுகின்றன. 14 இந்த முடிவுகள், மனித எலும்பு தசை நார்களை MYH ஐ அடிப்படையாகக் கொண்டு மூன்று தனித்துவமான வகுப்புகளாகப் பிரிக்காமல், அவற்றின் வளர்சிதை மாற்ற மற்றும் சுருக்க பண்புகளின் அடிப்படையில் இரண்டு கொத்தாகப் பிரித்த தசை நார் வகைப்பாட்டின் 20 ஆம் நூற்றாண்டின் முற்பகுதி பார்வைக்குத் திரும்ப வேண்டும் என்று கூறுகின்றன. 63
மிக முக்கியமாக, மயோஃபைபர் பன்முகத்தன்மையை பல பரிமாணங்களில் கருத்தில் கொள்ள வேண்டும். முந்தைய "ஓமிக்ஸ்" ஆய்வுகள் இந்த திசையில் சுட்டிக்காட்டியுள்ளன, எலும்பு தசை நார்கள் தனித்தனி கொத்துக்களை உருவாக்குவதில்லை, ஆனால் ஒரு தொடர்ச்சியில் அமைக்கப்பட்டிருக்கின்றன என்பதைக் குறிக்கின்றன. 11, 13, 14, 64, 71 இங்கே, எலும்பு தசையின் சுருக்க மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற பண்புகளில் உள்ள வேறுபாடுகளுக்கு கூடுதலாக, மயோஃபைபர்களை செல்-செல் தொடர்புகள் மற்றும் மொழிபெயர்ப்பு வழிமுறைகள் தொடர்பான அம்சங்களால் வேறுபடுத்தலாம் என்பதைக் காட்டுகிறோம். உண்மையில், எலும்பு தசை நார்களில் ரைபோசோம் பன்முகத்தன்மையைக் கண்டறிந்தோம், இது மெதுவான மற்றும் வேகமான ஃபைபர் வகைகளிலிருந்து சுயாதீனமான பன்முகத்தன்மைக்கு பங்களிக்கிறது. மெதுவான மற்றும் வேகமான ஃபைபர் வகையிலிருந்து சுயாதீனமான இந்த கணிசமான மயோஃபைபர் பன்முகத்தன்மைக்கான அடிப்படைக் காரணம் தெளிவாக இல்லை, ஆனால் இது குறிப்பிட்ட சக்திகள் மற்றும் சுமைகளுக்கு உகந்ததாக பதிலளிக்கும் தசை பாசிக்கிள்களுக்குள் சிறப்பு இடஞ்சார்ந்த அமைப்பை சுட்டிக்காட்டலாம்,72 தசை நுண்ணிய சூழலில் உள்ள பிற செல் வகைகளுடன் சிறப்பு செல்லுலார் அல்லது உறுப்பு-குறிப்பிட்ட தொடர்பு73,74,75 அல்லது தனிப்பட்ட மயோஃபைபர்களுக்குள் ரைபோசோம் செயல்பாட்டில் உள்ள வேறுபாடுகள்73,74,75. உண்மையில், RPL3 மற்றும் RPL3L இன் பாராலோகஸ் மாற்றீடு மூலமாகவோ அல்லது rRNA இன் 2′O-மெத்திலேஷன் மட்டத்திலோ ரைபோசோமால் ஹீட்டோரோபிளாஸ்மி, எலும்பு தசை ஹைபர்டிராஃபியுடன் தொடர்புடையதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது76,77. தனிப்பட்ட மயோஃபைபர்களின் செயல்பாட்டு குணாதிசயத்துடன் இணைந்த மல்டி-ஓமிக் மற்றும் ஸ்பேஷியல் பயன்பாடுகள் மல்டி-ஓமிக் மட்டத்தில் தசை உயிரியலைப் பற்றிய நமது புரிதலை மேலும் மேம்படுத்தும்78.
நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளிடமிருந்து ஒற்றை மயோஃபைபர்களின் புரோட்டியோம்களை பகுப்பாய்வு செய்வதன் மூலம், எலும்பு தசையின் மருத்துவ நோய்க்குறியியல் இயற்பியலை தெளிவுபடுத்துவதற்கு ஒற்றை மயோஃபைபர் புரோட்டியோமிக்ஸின் பயன்பாடு, செயல்திறன் மற்றும் பொருந்தக்கூடிய தன்மையையும் நாங்கள் நிரூபித்தோம். மேலும், எங்கள் பணிப்பாய்வை உலகளாவிய புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வோடு ஒப்பிடுவதன் மூலம், ஒற்றை மயோஃபைபர் புரோட்டியோமிக்ஸ் உலகளாவிய திசு புரோட்டியோமிக்ஸைப் போலவே அதே ஆழமான தகவலை அளிக்கிறது என்பதையும், இன்டர்ஃபைபர் பன்முகத்தன்மை மற்றும் மயோஃபைபர் வகையைக் கணக்கிடுவதன் மூலம் இந்த ஆழத்தை விரிவுபடுத்துகிறது என்பதையும் நிரூபிக்க முடிந்தது. ஆரோக்கியமான கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதிகளில் காணப்பட்ட ஃபைபர் வகை விகிதத்தில் எதிர்பார்க்கப்படும் (மாறி இருந்தாலும்) வேறுபாடுகளுக்கு கூடுதலாக,19 MYH-மத்தியஸ்த ஃபைபர் வகை மாறுதலிலிருந்து சுயாதீனமான ஆக்ஸிஜனேற்ற மற்றும் புற-செல்லுலார் மறுவடிவமைப்பையும் நாங்கள் கவனித்தோம். TNNT1 நெமலின் மயோபதிகளில் ஃபைப்ரோஸிஸ் முன்னர் பதிவாகியுள்ளது.19 இருப்பினும், ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளிடமிருந்து மயோஃபைபர்களில், சார்கோலெமல் பழுதுபார்க்கும் வழிமுறைகளில் ஈடுபடும் அனெக்சின்கள் போன்ற புற-செல்லுலார் சுரக்கும் மன அழுத்தம் தொடர்பான புரதங்களின் அதிகரித்த அளவை வெளிப்படுத்துவதன் மூலம் எங்கள் பகுப்பாய்வு இந்தக் கண்டுபிடிப்பை உருவாக்குகிறது.57,58,59 முடிவில், நெமலின் மயோபதி நோயாளிகளிடமிருந்து மயோஃபைபர்களில் அதிகரித்த அனெக்சின் அளவுகள் கடுமையான அட்ரோபிக் மயோஃபைபர்களை சரிசெய்ய செல்லுலார் பதிலைக் குறிக்கலாம்.
இந்த ஆய்வு இன்றுவரை மனிதர்களின் மிகப்பெரிய ஒற்றை-ஃபைபர் முழு-தசை-ஓமிக்ஸ் பகுப்பாய்வை பிரதிநிதித்துவப்படுத்துகிறது என்றாலும், இது வரம்புகள் இல்லாமல் இல்லை. பங்கேற்பாளர்களின் ஒப்பீட்டளவில் சிறிய மற்றும் ஒரே மாதிரியான மாதிரியிலிருந்தும் ஒரு தசையிலிருந்தும் (வாஸ்டஸ் லேட்டரலிஸ்) எலும்பு தசை நார்களை நாங்கள் தனிமைப்படுத்தினோம். எனவே, தசை வகைகள் மற்றும் தசை உடலியலின் உச்சநிலைகளில் குறிப்பிட்ட ஃபைபர் மக்கள்தொகை இருப்பதை விலக்குவது சாத்தியமற்றது. எடுத்துக்காட்டாக, அதிக பயிற்சி பெற்ற ஸ்ப்ரிண்டர்கள் மற்றும்/அல்லது வலிமை விளையாட்டு வீரர்களில் 79 அல்லது தசை செயலற்ற காலங்களில் 66,80 அல்ட்ராஃபாஸ்ட் ஃபைபர்களின் துணைக்குழு (எ.கா., தூய 2X ஃபைபர்கள்) வெளிப்படுவதற்கான சாத்தியக்கூறுகளை நாங்கள் விலக்க முடியாது. மேலும், ஃபைபர் வகை விகிதங்கள் ஆண்களுக்கும் பெண்களுக்கும் இடையில் வேறுபடுவதாக அறியப்படுவதால், ஃபைபர் பன்முகத்தன்மையில் பாலின வேறுபாடுகளை ஆராய்வதில் இருந்து பங்கேற்பாளர்களின் வரையறுக்கப்பட்ட மாதிரி அளவு எங்களைத் தடுத்தது. மேலும், ஒரே தசை நார்கள் அல்லது அதே பங்கேற்பாளர்களின் மாதிரிகளில் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வுகளை நடத்த முடியவில்லை. நாமும் மற்றவர்களும் ஓமிக்ஸ் பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி ஒற்றை செல் மற்றும் ஒற்றை-மயோஃபைபர் பகுப்பாய்வுகளை மேம்படுத்தி, மிகக் குறைந்த மாதிரி உள்ளீட்டை அடைய (மைட்டோகாண்ட்ரியல் மயோபதி நோயாளிகளிடமிருந்து வரும் இழைகளின் பகுப்பாய்வில் இங்கே காட்டப்பட்டுள்ளபடி) தொடர்ந்து செயல்படுவதால், ஒற்றை தசை நார்களுக்குள் மல்டி-ஓமிக்ஸ் (மற்றும் செயல்பாட்டு) அணுகுமுறைகளை இணைப்பதற்கான வாய்ப்பு தெளிவாகிறது.
ஒட்டுமொத்தமாக, எங்கள் தரவு எலும்பு தசை பன்முகத்தன்மையின் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் மற்றும் பிந்தைய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் இயக்கிகளை அடையாளம் கண்டு விளக்குகிறது. குறிப்பாக, ஃபைபர் வகைகளின் கிளாசிக்கல் MYH அடிப்படையிலான வரையறையுடன் தொடர்புடைய எலும்பு தசை உடலியலில் நீண்டகால கோட்பாட்டை சவால் செய்யும் தரவை நாங்கள் வழங்குகிறோம். விவாதத்தை புதுப்பித்து, இறுதியில் எலும்பு தசை நார் வகைப்பாடு மற்றும் பன்முகத்தன்மை பற்றிய நமது புரிதலை மறுபரிசீலனை செய்ய நாங்கள் நம்புகிறோம்.
பதினான்கு காகசியன் பங்கேற்பாளர்கள் (12 ஆண்கள் மற்றும் 2 பெண்கள்) இந்த ஆய்வில் பங்கேற்க தானாக முன்வந்து ஒப்புக்கொண்டனர். இந்த ஆய்வு கென்ட் பல்கலைக்கழக மருத்துவமனையின் (BC-10237) நெறிமுறைக் குழுவால் அங்கீகரிக்கப்பட்டது, 2013 ஹெல்சின்கி பிரகடனத்திற்கு இணங்க, ClinicalTrials.gov (NCT05131555) இல் பதிவு செய்யப்பட்டது. பங்கேற்பாளர்களின் பொதுவான பண்புகள் துணை அட்டவணை 1 இல் வழங்கப்பட்டுள்ளன. வாய்மொழி மற்றும் எழுத்துப்பூர்வ தகவலறிந்த ஒப்புதலைப் பெற்ற பிறகு, ஆய்வில் இறுதிச் சேர்க்கைக்கு முன் பங்கேற்பாளர்கள் மருத்துவ பரிசோதனைக்கு உட்படுத்தப்பட்டனர். பங்கேற்பாளர்கள் இளமையாக இருந்தனர் (22–42 வயது), ஆரோக்கியமானவர்கள் (மருத்துவ நிலைமைகள் இல்லை, புகைபிடித்தல் வரலாறு இல்லை), மற்றும் மிதமான உடல் சுறுசுறுப்புடன் இருந்தனர். முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி உடல் தகுதியை மதிப்பிடுவதற்கு ஒரு படி எர்கோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி அதிகபட்ச ஆக்ஸிஜன் உட்கொள்ளல் தீர்மானிக்கப்பட்டது. 81
தசை பயாப்ஸி மாதிரிகள் ஓய்வு நிலையிலும், உண்ணாவிரத நிலையிலும் 14 நாட்கள் இடைவெளியில் மூன்று முறை சேகரிக்கப்பட்டன. இந்த மாதிரிகள் ஒரு பெரிய ஆய்வின் ஒரு பகுதியாக சேகரிக்கப்பட்டதால், பங்கேற்பாளர்கள் பயாப்ஸிக்கு 40 நிமிடங்களுக்கு முன்பு மருந்துப்போலி (லாக்டோஸ்), H1- ஏற்பி எதிரி (540 மி.கி ஃபெக்ஸோஃபெனாடின்) அல்லது H2- ஏற்பி எதிரி (40 மி.கி ஃபேமோடிடைன்) ஆகியவற்றை உட்கொண்டனர். இந்த ஹிஸ்டமைன் ஏற்பி எதிரிகள் ஓய்வெடுக்கும் எலும்பு தசை உடற்தகுதியை பாதிக்காது என்பதை நாங்கள் முன்பு நிரூபித்துள்ளோம்81, மேலும் எங்கள் தரக் கட்டுப்பாட்டுத் திட்டங்களில் நிலை தொடர்பான கிளஸ்டரிங் எதுவும் காணப்படவில்லை (துணை புள்ளிவிவரங்கள் 3 மற்றும் 6). ஒவ்வொரு பரிசோதனை நாளுக்கும் 48 மணி நேரத்திற்கு முன்பு ஒரு தரப்படுத்தப்பட்ட உணவு (41.4 கிலோகலோரி/கிலோ உடல் எடை, 5.1 கிராம்/கிலோ உடல் எடை கார்போஹைட்ரேட், 1.4 கிராம்/கிலோ உடல் எடை புரதம் மற்றும் 1.6 கிராம்/கிலோ உடல் எடை கொழுப்பு) பராமரிக்கப்பட்டது, மேலும் சோதனை நாளின் காலையில் ஒரு தரப்படுத்தப்பட்ட காலை உணவு (1.5 கிராம்/கிலோ உடல் எடை கார்போஹைட்ரேட்) உட்கொள்ளப்பட்டது. உள்ளூர் மயக்க மருந்தின் கீழ் (எபினெஃப்ரின் இல்லாமல் 0.5 மில்லி 1% லிடோகைன்), பெர்குடேனியஸ் பெர்க்ஸ்ட்ரோம் ஆஸ்பிரேஷன் பயன்படுத்தி வாஸ்டஸ் லேட்டரலிஸ் தசையிலிருந்து தசை பயாப்ஸிகள் பெறப்பட்டன. 82 தசை மாதிரிகள் உடனடியாக RNA இல் பதிக்கப்பட்டு, கைமுறையாக ஃபைபர் பிரித்தல் வரை (3 நாட்கள் வரை) 4°C இல் சேமிக்கப்பட்டன.
புதிதாக தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மயோஃபைபர் மூட்டைகள் ஒரு வளர்ப்பு டிஷில் புதிய RNA-பின்னர் ஊடகத்திற்கு மாற்றப்பட்டன. பின்னர் தனிப்பட்ட மயோஃபைபர்கள் ஒரு ஸ்டீரியோமைக்ரோஸ்கோப் மற்றும் நுண்ணிய சாமணம் பயன்படுத்தி கைமுறையாகப் பிரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு பயாப்ஸியிலிருந்தும் இருபத்தைந்து இழைகள் பிரிக்கப்பட்டன, பயாப்ஸியின் வெவ்வேறு பகுதிகளிலிருந்து இழைகளைத் தேர்ந்தெடுப்பதில் சிறப்பு கவனம் செலுத்தப்பட்டன. பிரித்தெடுத்த பிறகு, ஒவ்வொரு இழையும் தேவையற்ற புரதங்கள் மற்றும் டிஎன்ஏவை அகற்ற புரோட்டினேஸ் கே மற்றும் டிஎன்ஏஸ் என்சைம்களைக் கொண்ட 3 μl லிசிஸ் பஃபரில் (சிங்கிள்ஷாட் செல் லிசிஸ் கிட், பயோ-ராட்) மெதுவாக மூழ்கடிக்கப்பட்டது. பின்னர் செல் லிசிஸ் மற்றும் புரதம்/டிஎன்ஏ அகற்றுதல் சுருக்கமான சுழல், மைக்ரோசென்ட்ரிஃபியூஜில் திரவத்தை சுழற்றுதல் மற்றும் அறை வெப்பநிலையில் (10 நிமிடம்) அடைகாத்தல் மூலம் தொடங்கப்பட்டது. பின்னர் லைசேட் ஒரு வெப்ப சுழற்சியில் (T100, பயோ-ராட்) 37°C இல் 5 நிமிடம், 75°C இல் 5 நிமிடம் அடைகாக்கப்பட்டது, பின்னர் உடனடியாக -80°C இல் மேலும் செயலாக்கம் வரை சேமிக்கப்பட்டது.
இல்லுமினா-இணக்கமான பாலிஅடினிலேட்டட் ஆர்என்ஏ நூலகங்கள், குவாண்ட்செக்-பூல் 3′ எம்ஆர்என்ஏ-சீக் லைப்ரரி பிரெப் கிட் (லெக்ஸோஜென்) ஐப் பயன்படுத்தி 2 µl மயோஃபைபர் லைசேட்டிலிருந்து தயாரிக்கப்பட்டன. விரிவான முறைகளை உற்பத்தியாளரின் கையேட்டில் காணலாம். இந்த செயல்முறை தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மூலம் முதல்-ஸ்ட்ராண்ட் சிடிஎன்ஏ தொகுப்புடன் தொடங்குகிறது, இதன் போது தனித்துவமான மூலக்கூறு அடையாளங்காட்டிகள் (யுஎம்ஐகள்) மற்றும் மாதிரி-குறிப்பிட்ட ஐ1 பார்கோடுகள் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டு மாதிரிகள் குவிவதை உறுதிசெய்து கீழ்நிலை செயலாக்கத்தின் போது தொழில்நுட்ப மாறுபாட்டைக் குறைக்கின்றன. 96 மயோஃபைபர்களில் இருந்து சிடிஎன்ஏ பின்னர் காந்த மணிகள் மூலம் தொகுக்கப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்படுகிறது, அதன் பிறகு ஆர்என்ஏ அகற்றப்பட்டு சீரற்ற ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தி இரண்டாவது-ஸ்ட்ராண்ட் தொகுப்பு செய்யப்படுகிறது. நூலகம் காந்த மணிகள் மூலம் சுத்திகரிக்கப்படுகிறது, பூல்-குறிப்பிட்ட ஐ5/ஐ7 குறிச்சொற்கள் சேர்க்கப்படுகின்றன, மேலும் பிசிஆர் பெருக்கப்படுகிறது. இறுதி சுத்திகரிப்பு படி இல்லுமினா-இணக்கமான நூலகங்களை உருவாக்குகிறது. ஒவ்வொரு நூலகக் குளத்தின் தரமும் உயர் உணர்திறன் சிறிய துண்டு டிஎன்ஏ பகுப்பாய்வு கிட் (அஜிலன்ட் டெக்னாலஜிஸ், டிஎன்எஃப்-477-0500) ஐப் பயன்படுத்தி மதிப்பிடப்பட்டது.
கியூபிட் அளவீட்டின் அடிப்படையில், குளங்கள் சமமோலார் செறிவுகளில் (2 nM) மேலும் தொகுக்கப்பட்டன. இதன் விளைவாக உருவான குளம் பின்னர் 2 nM ஏற்றுதல் (4% PhiX) உடன் NovaSeq S2 ரீஜென்ட் கிட் (1 × 100 நியூக்ளியோடைடுகள்) ஐப் பயன்படுத்தி நிலையான முறையில் NovaSeq 6000 கருவியில் வரிசைப்படுத்தப்பட்டது.
எங்கள் பைப்லைன் லெக்ஸோஜனின் QuantSeq பூல் தரவு பகுப்பாய்வு பைப்லைனை (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) அடிப்படையாகக் கொண்டது. i7/i5 குறியீட்டை அடிப்படையாகக் கொண்ட bcl2fastq2 (v2.20.0) உடன் தரவு முதலில் டீமல்டிபிளக்ஸ் செய்யப்பட்டது. ரீட் 2 பின்னர் ஐ1 மாதிரி பார்கோடை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஐடெமக்ஸ் (v0.1.6) உடன் டீமல்டிபிளக்ஸ் செய்யப்பட்டது மற்றும் UMI வரிசைகள் umi_tools (v1.0.1) உடன் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. பின்னர் குறுகிய வாசிப்புகளை (<20 நீளம்) அல்லது அடாப்டர் வரிசைகளை மட்டுமே கொண்ட வாசிப்புகளை அகற்ற பல சுற்றுகளில் கட்அடாப்ட் (v3.4) உடன் ட்ரிம் செய்யப்பட்டது. பின்னர் வாசிப்புகள் STAR (v2.6.0c) ஐப் பயன்படுத்தி மனித மரபணுவுடன் சீரமைக்கப்பட்டன, மேலும் BAM கோப்புகள் SAMtools (v1.11) உடன் அட்டவணைப்படுத்தப்பட்டன. umi_tools (v1.0.1) ஐப் பயன்படுத்தி நகல் வாசிப்புகள் அகற்றப்பட்டன. இறுதியாக, சப்ரீடில் (v2.0.3) உள்ள அம்ச எண்ணிக்கைகளைப் பயன்படுத்தி சீரமைப்பு எண்ணுதல் செய்யப்பட்டது. குழாய்வழியின் பல இடைநிலை நிலைகளில் FastQC (v0.11.9) ஐப் பயன்படுத்தி தரக் கட்டுப்பாடு செய்யப்பட்டது.
மேலும் அனைத்து உயிர் தகவலியல் செயலாக்கமும் காட்சிப்படுத்தலும் R (v4.2.3) இல் முதன்மையாக Seurat (v4.4.0) பணிப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டன. 83 எனவே, தனிப்பட்ட UMI மதிப்புகள் மற்றும் மெட்டாடேட்டா மெட்ரிக்குகள் Seurat பொருள்களாக மாற்றப்பட்டன. அனைத்து இழைகளிலும் 30% க்கும் குறைவாக வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்கள் அகற்றப்பட்டன. 1000 UMI மதிப்புகள் மற்றும் 1000 கண்டறியப்பட்ட மரபணுக்களின் குறைந்தபட்ச வரம்பின் அடிப்படையில் குறைந்த தரமான மாதிரிகள் அகற்றப்பட்டன. இறுதியில், 925 இழைகள் அனைத்து தரக் கட்டுப்பாட்டு வடிகட்டுதல் படிகளையும் கடந்துவிட்டன. Seurat SCTransform v2 முறையைப் பயன்படுத்தி UMI மதிப்புகள் இயல்பாக்கப்பட்டன, 84 கண்டறியப்பட்ட அனைத்து 7418 அம்சங்களையும் உள்ளடக்கியது, மேலும் பங்கேற்பாளர்களுக்கு இடையிலான வேறுபாடுகள் பின்வாங்கப்பட்டன. அனைத்து தொடர்புடைய மெட்டாடேட்டாவையும் துணை தரவுத்தொகுப்பு 28 இல் காணலாம்.