மயோசின் கன சங்கிலிக்கு அப்பாற்பட்ட மனித எலும்புத் தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மை

nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்தைப் பெற, சமீபத்திய உலாவிப் பதிப்பைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். மேலும், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்யும் வகையில், இந்தத் தளத்தில் ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இருக்காது.
எலும்புத் தசை என்பது பெரும்பாலும் மயோஃபைப்ரில்களால் ஆன ஒரு பன்முகத்தன்மை கொண்ட திசுவாகும். மனிதர்களில், இவை பொதுவாக மூன்று வகைகளாகப் பிரிக்கப்படுகின்றன: ஒன்று "மெதுவானது" (வகை 1) மற்றும் இரண்டு "வேகமானது" (வகை 2A மற்றும் 2X). இருப்பினும், பாரம்பரிய மயோஃபைப்ரில் வகைகளுக்கு இடையேயும் உள்ளேயும் உள்ள பன்முகத்தன்மை இன்னும் முழுமையாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. நாங்கள் மனித வாஸ்டஸ் லேட்டராலிஸ் தசையிலிருந்து முறையே 1050 மற்றும் 1038 தனிப்பட்ட மயோஃபைப்ரில்களுக்கு டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் அணுகுமுறைகளைப் பயன்படுத்தினோம். புரோட்டியோமிக் ஆய்வில் ஆண்களும், டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் ஆய்வில் 10 ஆண்களும் 2 பெண்களும் சேர்க்கப்பட்டனர். மயோசின் ஹெவி செயின் ஐசோஃபார்ம்கள் தவிர, வளர்சிதை மாற்றப் புரதங்கள், ரைபோசோமல் புரதங்கள் மற்றும் செல்லுலார் சந்திப்புப் புரதங்கள் ஆகியவற்றையும் பன்முகப் பரிமாண மயோஃபைப்ரில்களுக்கு இடையேயான மாறுபாட்டின் ஆதாரங்களாக நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம். மேலும், மெதுவான மற்றும் வேகமான இழைகளின் தொகுப்புகள் அடையாளம் காணப்பட்ட போதிலும், வகை 2X இழைகள் மற்ற வேகமான சுருங்கும் இழைகளிலிருந்து புறத்தோற்ற ரீதியாக வேறுபடுத்த முடியாதவை என்று எங்கள் தரவுகள் தெரிவிக்கின்றன. மேலும், நெமலைன் தசை நோய்களில் தசைநார் புறத்தோற்றத்தை விவரிக்க, மயோசின் கன சங்கிலியை அடிப்படையாகக் கொண்ட வகைப்பாடு போதுமானதாக இல்லை. ஒட்டுமொத்தமாக, மயோசின் கன சங்கிலி ஐசோஃபார்ம்களுக்கு அப்பாற்பட்ட மாறுபாடுகளின் மூலங்களுடன், தசைநார் பன்முகத்தன்மை இருப்பதை எங்கள் தரவுகள் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
செல்லுலார் பன்முகத்தன்மை என்பது அனைத்து உயிரியல் அமைப்புகளின் உள்ளார்ந்த அம்சமாகும், இது திசுக்கள் மற்றும் செல்களின் வெவ்வேறு தேவைகளைப் பூர்த்தி செய்ய செல்களைத் தனித்தன்மை பெற அனுமதிக்கிறது.¹ எலும்புத் தசை நார் பன்முகத்தன்மை பற்றிய பாரம்பரியக் கண்ணோட்டம் என்னவென்றால், ஒரு மோட்டார் யூனிட்டிற்குள் மோட்டார் நியூரான்கள் நார் வகையை வரையறுக்கின்றன, மேலும் நார் வகை (அதாவது, மனிதர்களில் வகை 1, வகை 2A, மற்றும் வகை 2X) மயோசின் ஹெவி செயின் (MYH) ஐசோஃபார்ம்களின் பண்புகளால் தீர்மானிக்கப்படுகிறது.² இது ஆரம்பத்தில் அவற்றின் pH ATPase நிலையற்ற தன்மையை அடிப்படையாகக் கொண்டது,³,⁴ பின்னர் அவற்றின் MYH மூலக்கூறு வெளிப்பாட்டை அடிப்படையாகக் கொண்டது.⁵ இருப்பினும், பல்வேறு விகிதங்களில் பல MYH-களை இணைந்து வெளிப்படுத்தும் "கலப்பு" நார்கள் அடையாளம் காணப்பட்டு பின்னர் ஏற்றுக்கொள்ளப்பட்டதால், எலும்புத் தசை நார்கள் தனித்துவமான நார் வகைகளாகக் கருதப்படாமல், ஒரு தொடர்ச்சியாகவே பார்க்கப்படுகின்றன.⁶ இருந்தபோதிலும், மயோஃபைபர் வகைப்பாட்டிற்கான முதன்மை வகைப்படுத்தியாக இந்தத் துறை இன்னும் MYH-ஐ பெரிதும் நம்பியுள்ளது. இந்தக் கண்ணோட்டம், ஆரம்பகால கொறி விலங்கு ஆய்வுகளின் வரம்புகள் மற்றும் குறிப்பிடத்தக்க சார்புகளால் பாதிக்கப்பட்டிருக்கலாம், அவற்றின் MYH வெளிப்பாட்டு சுயவிவரங்களும் நார் வகைகளின் வரம்பும் மனிதர்களிடமிருந்து வேறுபடுகின்றன.² வெவ்வேறு மனித எலும்புத் தசைகள் பலதரப்பட்ட வேறுபாடுகளைக் காட்டுவதால் இந்த நிலைமை மேலும் சிக்கலாகிறது. நார் வகைகள்.7 வாஸ்டஸ் லேட்டராலிஸ் என்பது ஒரு இடைநிலை (எனவே பிரதிநிதித்துவ) MYH வெளிப்பாட்டு சுயவிவரத்தைக் கொண்ட ஒரு கலப்புத் தசையாகும்.7 மேலும், இதிலிருந்து மாதிரிகளை எளிதாக எடுக்க முடிவதால், இது மனிதர்களில் மிகச்சிறப்பாக ஆய்வு செய்யப்பட்ட தசையாக விளங்குகிறது.
எனவே, சக்திவாய்ந்த “ஓமிக்ஸ்” கருவிகளைப் பயன்படுத்தி எலும்புத் தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மையை பாரபட்சமின்றி ஆய்வு செய்வது மிகவும் முக்கியமானது, ஆனால் எலும்புத் தசை நார்களின் பல உட்கருக்கள் கொண்ட தன்மை காரணமாக இது சவாலானதாகவும் உள்ளது. இருப்பினும், சமீபத்திய ஆண்டுகளில் பல்வேறு தொழில்நுட்ப முன்னேற்றங்கள் காரணமாக டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ்8,9 மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ்10 தொழில்நுட்பங்கள் உணர்திறனில் ஒரு புரட்சியை அடைந்துள்ளன, இது எலும்புத் தசையை ஒற்றை-நார் தெளிவுத்திறனில் பகுப்பாய்வு செய்ய அனுமதிக்கிறது. இதன் விளைவாக, ஒற்றை-நார் பன்முகத்தன்மையை வகைப்படுத்துவதிலும், தசைச் சிதைவு தூண்டுதல்கள் மற்றும் முதுமைக்கு அவற்றின் பதிலளிப்பிலும்11,12,13,14,15,16,17,18 குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றம் ஏற்பட்டுள்ளது. முக்கியமாக, இந்த தொழில்நுட்ப முன்னேற்றங்கள் மருத்துவப் பயன்பாடுகளைக் கொண்டுள்ளன, இது நோய் தொடர்பான ஒழுங்கின்மையை மிகவும் விரிவாகவும் துல்லியமாகவும் வகைப்படுத்த அனுமதிக்கிறது. உதாரணமாக, மிகவும் பொதுவான பரம்பரை தசை நோய்களில் ஒன்றான (MIM 605355 மற்றும் MIM 161800) நெமலைன் மயோபதியின் நோய்ப் உடலியல் சிக்கலானதாகவும் குழப்பமானதாகவும் உள்ளது.¹⁹,²⁰ எனவே, எலும்புத் தசை நார்களின் ஒழுங்கின்மையைச் சிறப்பாக வகைப்படுத்துவது, இந்த நோயைப் பற்றிய நமது புரிதலில் குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றங்களுக்கு வழிவகுக்கும்.
மனித பயாப்ஸி மாதிரிகளிலிருந்து கையால் பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஒற்றை எலும்புத் தசை நார்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வுக்கான முறைகளை நாங்கள் உருவாக்கி, அவற்றை ஆயிரக்கணக்கான நார்களுக்குப் பயன்படுத்தினோம். இது மனித எலும்புத் தசை நார்களின் செல்லுலார் பன்முகத்தன்மையை ஆராய எங்களுக்கு உதவியது. இந்த ஆய்வின் போது, ​​தசை நார்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் ஃபீனோடைப்பிங்கின் ஆற்றலை நாங்கள் நிரூபித்தோம். மேலும், வளர்சிதை மாற்ற, ரைபோசோமல் மற்றும் செல்லுலார் சந்திப்புப் புரதங்களை நார்களுக்கு இடையேயான மாறுபாட்டின் முக்கிய ஆதாரங்களாக அடையாளம் கண்டோம். அதுமட்டுமின்றி, இந்த புரோட்டியோமிக் செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி, ஒற்றை எலும்புத் தசை நார்களில் நெமடோட் மயோபதியின் மருத்துவ முக்கியத்துவத்தை நாங்கள் வகைப்படுத்தினோம். இது, MYH-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்டு, நார் வகையைச் சாராமல் ஆக்சிஜனேற்றமற்ற நார்களை நோக்கிய ஒரு ஒருங்கிணைந்த மாற்றத்தை வெளிப்படுத்தியது.
மனித எலும்புத் தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மையை ஆராய்வதற்காக, தனிப்பட்ட எலும்புத் தசை நார்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மற்றும் புரோட்டியோம் பகுப்பாய்வைச் செயல்படுத்த இரண்டு பணிப்பாய்வுகளை நாங்கள் உருவாக்கினோம் (படம் 1A மற்றும் துணைப் படம் 1A). மாதிரி சேமிப்பு மற்றும் ஆர்.என்.ஏ மற்றும் புரதத்தின் ஒருமைப்பாட்டைப் பாதுகாப்பது முதல் ஒவ்வொரு அணுகுமுறைக்குமான செயல் திறனை மேம்படுத்துவது வரை பல வழிமுறைப் படிகளை நாங்கள் உருவாக்கி மேம்படுத்தினோம். டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் பகுப்பாய்விற்காக, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் ஆரம்ப கட்டத்தில் மாதிரி-குறிப்பிட்ட மூலக்கூறு பார்கோடுகளைச் செருகுவதன் மூலம் இது அடையப்பட்டது, இது திறமையான பின்தொடர் செயலாக்கத்திற்காக 96 நார்களை ஒன்றிணைக்க அனுமதித்தது. பாரம்பரிய ஒற்றை-செல் அணுகுமுறைகளுடன் ஒப்பிடும்போது ஆழமான வரிசைப்படுத்தல் (ஒரு நாருக்கு ±1 மில்லியன் ரீடுகள்) டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் தரவை மேலும் செறிவூட்டியது. 21 புரோட்டியோமிக்ஸிற்காக, அதிக செயல் திறனைப் பராமரிக்கும் அதே வேளையில் புரோட்டியோம் ஆழத்தை மேம்படுத்த, ஒரு டிம்ஸ்டாஃப் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரில் டி.ஐ.ஏ-பாசெஃப் தரவு கையகப்படுத்தலுடன் இணைந்த ஒரு குறுகிய குரோமடோகிராஃபிக் சாய்வை (21 நிமிடங்கள்) நாங்கள் பயன்படுத்தினோம். 22,23 ஆரோக்கியமான எலும்புத் தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மையை ஆராய்வதற்காக, 14 ஆரோக்கியமான வயதுவந்த கொடையாளர்களிடமிருந்து பெறப்பட்ட 1,050 தனிப்பட்ட நார்களின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்களையும், 5 ஆரோக்கியமான வயதுவந்த கொடையாளர்களிடமிருந்து பெறப்பட்ட 1,038 நார்களின் புரோட்டியோம்களையும் நாங்கள் வகைப்படுத்தினோம் (துணை அட்டவணை 1). இந்த ஆய்வறிக்கையில், இந்தத் தரவுத்தொகுப்புகள் முறையே 1,000-நார் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்கள் மற்றும் புரோட்டியோம்கள் எனக் குறிப்பிடப்படுகின்றன. எங்களின் அணுகுமுறை, 1,000-நார் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வுகளில் மொத்தம் 27,237 டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளையும் 2,983 புரதங்களையும் கண்டறிந்தது (படம் 1A, துணைத் தரவுத்தொகுப்புகள் 1–2). ஒரு நாருக்கு 1,000-க்கும் மேற்பட்ட கண்டறியப்பட்ட மரபணுக்கள் மற்றும் 50% செல்லுபடியாகும் மதிப்புகளுக்காக டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் தரவுத்தொகுப்புகளை வடிகட்டிய பிறகு, டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மற்றும் புரோட்டியோமில் முறையே 925 மற்றும் 974 நார்களுக்குத் தொடர்ச்சியான பயோஇன்ஃபர்மேட்டிக்ஸ் பகுப்பாய்வுகள் செய்யப்பட்டன. வடிகட்டிய பிறகு, ஒரு இழைக்கு சராசரியாக 4257 ± 1557 மரபணுக்களும் 2015 ± 234 புரதங்களும் (சராசரி ± திட்ட விலகல்) கண்டறியப்பட்டன, மேலும் தனிநபர்களுக்கிடையேயான மாறுபாடு குறைவாக இருந்தது (துணைப் படங்கள் 1B–C, துணைத் தரவுத்தொகுப்புகள் 3–4). இருப்பினும், பங்கேற்பாளர்களிடையே அக-ஆய்வு மாறுபாடு மிகவும் அதிகமாக இருந்தது, இது வெவ்வேறு நீளங்கள் மற்றும் குறுக்குவெட்டுப் பரப்புகளைக் கொண்ட இழைகளுக்கு இடையிலான ஆர்.என்.ஏ/புரத விளைச்சலில் உள்ள வேறுபாடுகளால் ஏற்பட்டிருக்கலாம். பெரும்பாலான புரதங்களுக்கு (>2000), மாறுபாட்டுக் குணகம் 20%-க்கும் குறைவாக இருந்தது (துணைப் படம் 1D). இரண்டு முறைகளும், தசைச் சுருக்கத்திற்கு முக்கியமான, அதிக வெளிப்பாட்டுத் தன்மைகளைக் கொண்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் புரதங்களின் (எ.கா., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) பரந்த இயக்க வரம்பைப் படம்பிடிக்க உதவின (துணைப் படங்கள் 1E–F). அடையாளம் காணப்பட்ட பெரும்பாலான அம்சங்கள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் தரவுத்தொகுப்புகளுக்கு இடையில் பொதுவானவையாக இருந்தன (துணைப் படம் 1G), மேலும் இந்த அம்சங்களின் சராசரி UMI/LFQ செறிவுகள் திருப்திகரமாகத் தொடர்புபடுத்தப்பட்டன (r = 0.52) (துணைப் படம் 1H).
டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் பணிப்பாய்வு (BioRender.com கொண்டு உருவாக்கப்பட்டது). BD MYH7, MYH2, மற்றும் MYH1-க்கான டைனமிக் ரேஞ்ச் வளைவுகள், மற்றும் ஃபைபர் வகை ஒதுக்கீட்டிற்காகக் கணக்கிடப்பட்ட வரம்புகள். E, F டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்புகளில் ஃபைபர்கள் முழுவதும் MYH வெளிப்பாட்டின் பரவல். G, H MYH-அடிப்படையிலான ஃபைபர் வகையின்படி வண்ணமிடப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸிற்கான யூனிஃபார்ம் டைவர்சிட்டி அப்ராக்ஸிமேஷன் அண்ட் ப்ரொஜெக்ஷன் (UMAP) வரைபடங்கள். I, J டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்புகளில் MYH7, MYH2, மற்றும் MYH1 வெளிப்பாட்டைக் காட்டும் ஃபீச்சர் வரைபடங்கள்.
ஓமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்புகளில் MYH வெளிப்பாட்டின் உயர் உணர்திறன் மற்றும் டைனமிக் வரம்பைப் பயன்படுத்திக்கொள்ளும் ஒரு மேம்படுத்தப்பட்ட அணுகுமுறையின் மூலம், ஒவ்வொரு இழைக்கும் MYH-அடிப்படையிலான இழை வகையை ஒதுக்குவதை நாங்கள் முதலில் நோக்கமாகக் கொண்டோம். முந்தைய ஆய்வுகள், வெவ்வேறு MYH-களின் வெளிப்பாட்டின் ஒரு நிலையான சதவீதத்தின் அடிப்படையில், இழைகளைத் தூய வகை 1, வகை 2A, வகை 2X அல்லது கலப்பு என வகைப்படுத்த தன்னிச்சையான வரம்புகளைப் பயன்படுத்தியுள்ளன¹¹,¹⁴,²⁴. நாங்கள் ஒரு வேறுபட்ட அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தினோம், அதில் ஒவ்வொரு இழையின் வெளிப்பாடும், இழைகளை வகைப்படுத்த நாங்கள் பயன்படுத்திய MYH-களால் தரவரிசைப்படுத்தப்பட்டது: MYH7, MYH2, மற்றும் MYH1, இவை முறையே வகை 1, வகை 2A, மற்றும் வகை 2X இழைகளுக்கு ஒத்திருந்தன. பின்னர், இதன் விளைவாகக் கிடைத்த ஒவ்வொரு வளைவின் கீழ் வளைவுப் புள்ளியையும் நாங்கள் கணிதரீதியாகக் கணக்கிட்டு, ஒவ்வொரு MYH-க்கும் இழைகளை நேர்மறை (வரம்பிற்கு மேல்) அல்லது எதிர்மறை (வரம்பிற்குக் கீழ்) என ஒதுக்க அதை ஒரு வரம்பாகப் பயன்படுத்தினோம் (படம் 1B–D). இந்தத் தரவுகள், புரத மட்டத்துடன் ஒப்பிடும்போது ஆர்.என்.ஏ மட்டத்தில் MYH7 (படம் 1B) மற்றும் MYH2 (படம் 1C) ஆகியவை மிகவும் தனித்துவமான ஆன்/ஆஃப் வெளிப்பாட்டு சுயவிவரங்களைக் கொண்டுள்ளன என்பதை நிரூபிக்கின்றன. உண்மையில், புரத மட்டத்தில், மிகச் சில இழைகள் மட்டுமே MYH7-ஐ வெளிப்படுத்தவில்லை, மேலும் எந்த இழையும் 100% MYH2 வெளிப்பாட்டைக் கொண்டிருக்கவில்லை. அடுத்து, ஒவ்வொரு தரவுத்தொகுப்பிலும் உள்ள அனைத்து இழைகளுக்கும் MYH-அடிப்படையிலான இழை வகைகளை ஒதுக்க, நாங்கள் முன்வரையறுக்கப்பட்ட வெளிப்பாட்டு வரம்புகளைப் பயன்படுத்தினோம். எடுத்துக்காட்டாக, MYH7+/MYH2-/MYH1- இழைகள் வகை 1-க்கு ஒதுக்கப்பட்டன, அதே நேரத்தில் MYH7-/MYH2+/MYH1+ இழைகள் கலப்பு வகை 2A/2X-க்கு ஒதுக்கப்பட்டன (முழுமையான விளக்கத்திற்கு துணை அட்டவணை 2-ஐப் பார்க்கவும்). அனைத்து இழைகளையும் ஒன்றாக இணைத்தபோது, ​​ஆர்.என்.ஏ (படம் 1E) மற்றும் புரத (படம் 1F) ஆகிய இரண்டு மட்டங்களிலும் MYH-அடிப்படையிலான இழை வகைகளின் குறிப்பிடத்தக்க ஒத்த பரவலைக் கண்டோம், அதே நேரத்தில் MYH-அடிப்படையிலான இழை வகைகளின் ஒப்பீட்டு அமைப்பு எதிர்பார்த்தபடி தனிநபர்களிடையே வேறுபட்டது (துணைப் படம் 2A). பெரும்பாலான இழைகள் தூய வகை 1 (34–35%) அல்லது வகை 2A (36–38%) என வகைப்படுத்தப்பட்டன, இருப்பினும் கணிசமான எண்ணிக்கையிலான கலப்பு வகை 2A/2X இழைகளும் (16–19%) கண்டறியப்பட்டன. ஒரு குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு என்னவென்றால், தூய வகை 2X இழைகளை RNA மட்டத்தில் மட்டுமே கண்டறிய முடிந்தது, ஆனால் புரத மட்டத்தில் கண்டறிய முடியவில்லை. இது, விரைவான MYH வெளிப்பாடு குறைந்தபட்சம் பகுதியளவு படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய நிலையில் ஒழுங்குபடுத்தப்படுகிறது என்பதைச் சுட்டிக்காட்டுகிறது.
ஆன்டிபாடி அடிப்படையிலான டாட் பிளாட்டிங்கைப் பயன்படுத்தி, எங்களின் புரோட்டியோமிக்ஸ் அடிப்படையிலான MYH ஃபைபர் வகைப்படுத்தும் முறையை நாங்கள் சரிபார்த்தோம். மேலும், தூய வகை 1 மற்றும் வகை 2A ஃபைபர்களை அடையாளம் காண்பதில் இரண்டு முறைகளும் 100% உடன்பாட்டைக் காட்டின (துணைப் படம் 2B-ஐப் பார்க்கவும்). இருப்பினும், புரோட்டியோமிக்ஸ் அடிப்படையிலான அணுகுமுறை அதிக உணர்திறன் கொண்டதாகவும், கலப்பு ஃபைபர்களை அடையாளம் காண்பதில் அதிக செயல்திறன் மிக்கதாகவும், ஒவ்வொரு ஃபைபரிலும் உள்ள ஒவ்வொரு MYH மரபணுவின் விகிதத்தை அளவிடுவதிலும் சிறப்பாகச் செயல்பட்டது. எலும்புத் தசை ஃபைபர் வகைகளின் தன்மையை விவரிக்க, ஒரு புறநிலை மற்றும் அதிக உணர்திறன் கொண்ட ஓமிக்ஸ் அடிப்படையிலான அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்துவதன் செயல்திறனை இந்தத் தரவுகள் நிரூபிக்கின்றன.
பின்னர், டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் வழங்கிய ஒருங்கிணைந்த தகவல்களைப் பயன்படுத்தி, தசை நார்களை அவற்றின் முழுமையான டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் அல்லது புரோட்டியோமின் அடிப்படையில் புறநிலையாக வகைப்படுத்தினோம். பரிமாணத்தை ஆறு முதன்மைக் கூறுகளாகக் குறைக்க யூனிஃபார்ம் மேனிஃபோல்ட் அப்ராக்ஸிமேஷன் அண்ட் ப்ரொஜெக்ஷன் (UMAP) முறையைப் பயன்படுத்தி (துணைப் படங்கள் 3A–B), டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் (படம் 1G) மற்றும் புரோட்டியோம் (படம் 1H) ஆகியவற்றில் தசை நார் மாறுபாட்டைக் காட்சிப்படுத்த முடிந்தது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் அல்லது புரோட்டியோமிக்ஸ் தரவுத்தொகுப்புகள் இரண்டிலும், தசை நார்கள் பங்கேற்பாளர்கள் (துணைப் படங்கள் 3C–D) அல்லது சோதனை நாட்கள் (துணைப் படம் 3E) அடிப்படையில் குழுப்படுத்தப்படவில்லை. இது, எலும்புத் தசை நார்களில் உள்ள நபருக்குள்ளான மாறுபாடு, நபர்களுக்கு இடையேயான மாறுபாட்டை விட அதிகமாக உள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது. UMAP வரைபடத்தில், "வேகமான" மற்றும் "மெதுவான" தசை நார்களைக் குறிக்கும் இரண்டு தனித்துவமான கொத்துகள் தோன்றின (படங்கள் 1G–H). MYH7+ (மெதுவான) தசைநாண்கள் UMAP1-இன் நேர்மின் முனையில் கொத்தாகக் காணப்பட்டன, அதேசமயம் MYH2+ மற்றும் MYH1+ (வேகமான) தசைநாண்கள் UMAP1-இன் எதிர்மின் முனையில் கொத்தாகக் காணப்பட்டன (படங்கள் 1I–J). இருப்பினும், MYH வெளிப்பாட்டின் அடிப்படையில் வேகத் துடிப்புத் தசைநாண் வகைகளுக்கு (அதாவது, வகை 2A, வகை 2X, அல்லது கலப்பு 2A/2X) இடையே எந்த வேறுபாடும் காட்டப்படவில்லை. இது, முழுமையான டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் அல்லது புரோட்டியோமைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது, ​​MYH1 (படம் 1I–J) அல்லது ACTN3 அல்லது MYLK2 (துணைப் படங்கள் 4A–B) போன்ற பிற பாரம்பரிய 2X தசைநாண் குறிப்பான்களின் வெளிப்பாடு வெவ்வேறு தசைநாண் வகைகளை வேறுபடுத்திக் காட்டுவதில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. மேலும், MYH2 மற்றும் MYH7 உடன் ஒப்பிடும்போது, ​​சில டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் அல்லது புரதங்கள் மட்டுமே MYH1 உடன் நேர்மறையாகத் தொடர்புடையதாக இருந்தன (துணைப் படங்கள் 4C–H). இது, MYH1-இன் மிகுதியானது தசைநாண் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்/புரோட்டியோமை முழுமையாகப் பிரதிபலிக்கவில்லை என்பதைக் காட்டுகிறது. UMAP மட்டத்தில் மூன்று MYH ஐசோஃபார்ம்களின் கலப்பு வெளிப்பாட்டை மதிப்பிடும்போதும் இதேபோன்ற முடிவுகள் எட்டப்பட்டன (துணைப் படங்கள் 4I–J). எனவே, MYH அளவீட்டின் அடிப்படையில் மட்டும் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் மட்டத்தில் 2X இழைகளை அடையாளம் காண முடிந்தாலும், முழு டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் அல்லது புரோட்டியோமைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது MYH1+ இழைகளை மற்ற வேக இழைகளிலிருந்து வேறுபடுத்தி அறிய முடியாது.
MYH-ஐத் தாண்டி மெது இழைகளின் பன்முகத்தன்மையை ஆரம்பகட்டமாக ஆராய்வதற்காக, TPM3, TNNT1, MYL3, மற்றும் ATP2A22 ஆகிய நான்கு நிறுவப்பட்ட மெது இழை வகை-சார்ந்த புரதங்களை நாங்கள் மதிப்பிட்டோம். டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் (துணைப் படம் 5A) மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் (துணைப் படம் 5B) ஆகிய இரண்டிலும், மெது இழை துணை வகைகள் MYH7 உடன் உயர்வான, இருப்பினும் முழுமையற்ற, பியர்சன் தொடர்புகளைக் காட்டின. டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் (துணைப் படம் 5C) மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் (துணைப் படம் 5D) ஆகியவற்றில் முறையே சுமார் 25% மற்றும் 33% மெது இழைகள் அனைத்து மரபணு/புரத துணை வகைகளாலும் தூய மெது இழைகளாக வகைப்படுத்தப்படவில்லை. எனவே, பல மரபணு/புரத துணை வகைகளின் அடிப்படையில் மெது இழைகளை வகைப்படுத்துவது, இழை வகை-சார்ந்தவை என அறியப்பட்ட புரதங்களுக்குக் கூட கூடுதல் சிக்கலை ஏற்படுத்துகிறது. இது, ஒரே மரபணு/புரதக் குடும்பத்தின் ஐசோஃபார்ம்களின் அடிப்படையில் இழைகளை வகைப்படுத்துவது, எலும்புத் தசை இழைகளின் உண்மையான பன்முகத்தன்மையை போதுமான அளவு பிரதிபலிக்காது என்பதை உணர்த்துகிறது.
முழு ஓமிக்ஸ் மாதிரியின் அளவில் மனித எலும்புத் தசை நார்களின் புறத்தோற்ற மாறுபாட்டை மேலும் ஆராய்வதற்காக, முதன்மைக் கூறுப் பகுப்பாய்வைப் (PCA) பயன்படுத்தி தரவுகளின் சார்பற்ற பரிமாணக் குறைப்பை நாங்கள் மேற்கொண்டோம் (படம் 2A). UMAP வரைபடங்களைப் போலவே, PCA மட்டத்தில் பங்கேற்பாளரோ அல்லது சோதனை நாளோ நார் கொத்துகளைப் பாதிக்கவில்லை (துணைப் படங்கள் 6A–C). இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளிலும், MYH-அடிப்படையிலான நார் வகை PC2-ஆல் விளக்கப்பட்டது. இது, மெதுவாகச் சுருங்கும் வகை 1 நார்களின் ஒரு கொத்தையும், வேகமாகச் சுருங்கும் வகை 2A, வகை 2X மற்றும் கலப்பு 2A/2X நார்களைக் கொண்ட இரண்டாவது கொத்தையும் காட்டியது (படம் 2A). இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளிலும், இந்த இரண்டு கொத்துகளும் ஒரு சிறிய எண்ணிக்கையிலான கலப்பு வகை 1/2A நார்களால் இணைக்கப்பட்டிருந்தன. எதிர்பார்த்தபடியே, முக்கிய PC இயக்கிகளின் மிகைப்பிரதிநிதித்துவப் பகுப்பாய்வு, PC2 சுருங்குதல் மற்றும் வளர்சிதை மாற்றக் குறிகாட்டிகளால் இயக்கப்படுகிறது என்பதை உறுதிப்படுத்தியது (படம் 2B மற்றும் துணைப் படங்கள் 6D–E, துணைத் தரவுத்தொகுப்புகள் 5–6). ஒட்டுமொத்தமாக, வேகமான தொகுப்பிற்குள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் முழுவதும் பரவியிருந்த 2X இழைகள் எனப்படும் இழைகளைத் தவிர, PC2 நெடுகிலும் உள்ள தொடர்ச்சியான மாறுபாட்டை விளக்குவதற்கு MYH-அடிப்படையிலான இழை வகை போதுமானதாகக் கண்டறியப்பட்டது.
A. MYH-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்டு, இழை வகைக்கு ஏற்ப வண்ணமிடப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மற்றும் புரோட்டியோம் தரவுத்தொகுப்புகளின் முதன்மைக் கூறுப் பகுப்பாய்வு (PCA) வரைபடங்கள். B. PC2 மற்றும் PC1-இல் உள்ள டிரான்ஸ்கிரிப்ட் மற்றும் புரத இயக்கிகளின் செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு. புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வானது clusterProfiler தொகுப்பு மற்றும் பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்யப்பட்ட p-மதிப்புகளைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது. C, D. டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் உள்ள செல் இடை ஒட்டுதல் மரபணு ஆன்காலஜி (GO) சொற்களுக்கு ஏற்பவும், புரோட்டியோமில் உள்ள கோஸ்டாமியர் GO சொற்களுக்கு ஏற்பவும் வண்ணமிடப்பட்ட PCA வரைபடங்கள். அம்புக்குறிகள் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் மற்றும் புரத இயக்கிகளையும் அவற்றின் திசைகளையும் குறிக்கின்றன. E, F. மெதுவான/வேகமான இழை வகையைச் சாராத வெளிப்பாட்டுச் சரிவுகளைக் காட்டும், மருத்துவ ரீதியாகப் பொருத்தமான அம்சங்களின் சீரான பன்மடி தோராயமாக்கல் மற்றும் திட்டமிடல் (UMAP) அம்ச வரைபடங்கள். G, H. டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்கள் மற்றும் புரோட்டியோம்களில் உள்ள PC2 மற்றும் PC1 இயக்கிகளுக்கு இடையேயான தொடர்புகள்.
எதிர்பாராதவிதமாக, MYH-அடிப்படையிலான தசைநார் வகை, மாறுபாட்டின் இரண்டாவது மிக உயர்ந்த அளவை (PC2) மட்டுமே விளக்கியது. இது, எலும்புத் தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மையை ஒழுங்குபடுத்துவதில் MYH-அடிப்படையிலான தசைநார் வகையுடன் தொடர்பில்லாத பிற உயிரியல் காரணிகள் (PC1) ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிக்கின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. PC1-இல் உள்ள முதன்மை இயக்கிகளின் மிகை-பிரதிநிதித்துவப் பகுப்பாய்வு, PC1-இல் உள்ள மாறுபாடு முதன்மையாக டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் உள்ள செல்-செல் ஒட்டுதல் மற்றும் ரைபோசோம் உள்ளடக்கம், மற்றும் புரோட்டியோமில் உள்ள கோஸ்டாமியர்கள் மற்றும் ரைபோசோமால் புரதங்கள் ஆகியவற்றால் தீர்மானிக்கப்படுகிறது என்பதை வெளிப்படுத்தியது (படம் 2B மற்றும் துணைப் படங்கள் 6D–E, துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 7). எலும்புத் தசைகளில், கோஸ்டாமியர்கள் Z-வட்டை சர்கோலெம்மாவுடன் இணைக்கின்றன மற்றும் விசைப் பரிமாற்றம் மற்றும் சமிக்ஞை அனுப்புதலில் ஈடுபட்டுள்ளன. 25 செல்-செல் ஒட்டுதல் (டிரான்ஸ்கிரிப்டோம், படம் 2C) மற்றும் கோஸ்டாமியர் (புரோட்டியோம், படம் 2D) அம்சங்களைப் பயன்படுத்தி வரையப்பட்ட விளக்கக் குறிப்பு PCA வரைபடங்கள், PC1-இல் ஒரு வலுவான இடதுபுற நகர்வைக் காட்டின. இது, இந்த அம்சங்கள் சில குறிப்பிட்ட நார்களில் செறிந்துள்ளன என்பதைக் குறிக்கிறது.
UMAP மட்டத்தில் தசைநார் இழைகளின் தொகுப்பாக்கத்தை இன்னும் விரிவாக ஆய்வு செய்ததில், பெரும்பாலான பண்புகள் தசைநார் இழைத் துணைக்குழுக்களுக்கு உரியதாக இல்லாமல், தசைநார் இழை வகையைச் சாராத MYH-அடிப்படையிலான வெளிப்பாட்டுச் சரிவைக் காட்டின என்பது தெரியவந்தது. CHCHD10 (நரம்புத்தசை நோய்), SLIT3 (தசைச் சிதைவு), CTDNEP1 (தசை நோய்) போன்ற நோயியல் நிலைகளுடன் தொடர்புடைய பல மரபணுக்களில் இந்தத் தொடர்ச்சி காணப்பட்டது (படம் 2E). நரம்பியல் கோளாறுகளுடன் தொடர்புடைய புரதங்கள் (UGDH), இன்சுலின் சமிக்ஞை (PHIP), மற்றும் படியெடுத்தல் (HIST1H2AB) உள்ளிட்ட புரதத்தொகுப்பு முழுவதிலும் இந்தத் தொடர்ச்சி காணப்பட்டது (படம் 2F). ஒட்டுமொத்தமாக, இந்தத் தரவுகள் வெவ்வேறு தசைநார் இழைகளில், இழை வகையைச் சாராத மெதுவான/வேகமான சுருக்கங்களின் பன்முகத்தன்மையில் ஒரு தொடர்ச்சியைக் குறிக்கின்றன.
சுவாரஸ்யமாக, PC2-வில் உள்ள இயக்கி மரபணுக்கள் நல்ல டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்-புரோட்டியோம் தொடர்பைக் காட்டின (r = 0.663) (படம் 2G), இது மெதுவான மற்றும் வேகமான சுருங்கும் இழை வகைகள், குறிப்பாக எலும்புத் தசை இழைகளின் சுருங்கும் மற்றும் வளர்சிதை மாற்றப் பண்புகள், படியெடுத்தல் மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், PC1-ல் உள்ள இயக்கி மரபணுக்கள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்-புரோட்டியோம் தொடர்பைக் காட்டவில்லை (r = -0.027) (படம் 2H), இது மெதுவான/வேகமான சுருங்கும் இழை வகைகளுடன் தொடர்பில்லாத மாறுபாடுகள் பெரும்பாலும் படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய முறையில் கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது. PC1-ல் உள்ள மாறுபாடுகள் முதன்மையாக ரைபோசோமல் மரபணு வகைப்பாட்டுச் சொற்களால் விளக்கப்பட்டதாலும், புரத மொழிபெயர்ப்பில் தீவிரமாகப் பங்கேற்று செல்வாக்கு செலுத்துவதன் மூலம் ரைபோசோம்கள் செல்லில் ஒரு முக்கிய மற்றும் சிறப்புப் பங்கை வகிப்பதாலும்,31 நாங்கள் அடுத்து இந்த எதிர்பாராத ரைபோசோமல் பன்முகத்தன்மையை ஆராயத் தொடங்கினோம்.
முதலில், GOCC சொல்லான “சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரைபோசோம்”-இல் உள்ள புரதங்களின் சார்பு மிகுதியின்படி, புரோட்டியோமிக்ஸ் முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு வரைபடத்திற்கு வண்ணமிட்டோம் (படம் 3A). இந்தச் சொல் PC1-இன் நேர்மறைப் பக்கத்தில் செறிவூட்டப்பட்டு, ஒரு சிறிய சரிவை விளைவித்தாலும், ரைபோசோமல் புரதங்கள் PC1-இன் இரு திசைகளிலும் பிரிவினையை இயக்குகின்றன (படம் 3A). PC1-இன் எதிர்மறைப் பக்கத்தில் செறிவூட்டப்பட்ட ரைபோசோமல் புரதங்களில் RPL18, RPS18, மற்றும் RPS13 ஆகியவை அடங்கும் (படம் 3B), அதேசமயம் RPL31, RPL35, மற்றும் RPL38 (படம் 3C) ஆகியவை PC1-இன் நேர்மறைப் பக்கத்தில் முக்கிய இயக்கிகளாக இருந்தன. சுவாரஸ்யமாக, மற்ற திசுக்களுடன் ஒப்பிடும்போது எலும்புத் தசைகளில் RPL38 மற்றும் RPS13 ஆகியவை அதிக அளவில் வெளிப்படுத்தப்பட்டன (துணைப் படம் 7A). PC1-இல் உள்ள இந்தத் தனித்துவமான ரைபோசோமல் அடையாளங்கள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் காணப்படவில்லை (துணைப் படம் 7B), இது படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய ஒழுங்குமுறையைக் குறிக்கிறது.
A. புரோட்டியோம் முழுவதும் உள்ள சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரைபோசோமல் மரபணு வகைப்பாட்டியல் (GO) சொற்களுக்கு ஏற்ப வண்ணமிடப்பட்ட முதன்மைக் கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) வரைபடம். PCA வரைபடத்தில் புரதத்தால் ஏற்படும் மாறுபாட்டின் திசையை அம்புக்குறிகள் குறிப்பிடுகின்றன. கோட்டின் நீளம், கொடுக்கப்பட்ட ஒரு புரதத்திற்கான முதன்மைக் கூறு மதிப்பெண்ணுக்கு ஒத்திருக்கிறது. B, C. RPS13 மற்றும் RPL38-க்கான PCA சிறப்புக் கூறு வரைபடங்கள். D. சைட்டோபிளாஸ்மிக் ரைபோசோமல் புரதங்களின் மேற்பார்வையற்ற படிநிலைத் தொகுப்புப் பகுப்பாய்வு. E. எலும்புத் தசை நார்களில் வெவ்வேறு செறிவுகளில் காணப்படும் ரைபோசோமல் புரதங்களை எடுத்துக்காட்டும் 80S ரைபோசோமின் கட்டமைப்பு மாதிரி (PDB: 4V6X). F. mRNA வெளியேறும் பாதைக்கு அருகில் அமைந்துள்ள, வெவ்வேறு விகிதவியல் கொண்ட ரைபோசோமல் புரதங்கள்.
ரைபோசோமால் பன்முகத்தன்மை மற்றும் சிறப்புத்தன்மை பற்றிய கருத்துக்கள் முன்னர் முன்மொழியப்பட்டுள்ளன, இதன் மூலம் தனித்துவமான ரைபோசோம் துணைக்குழுக்களின் (ரைபோசோமால் பன்முகத்தன்மை) இருப்பு, குறிப்பிட்ட mRNA டிரான்ஸ்கிரிப்ட் தொகுப்புகளின்34 (ரைபோசோம் சிறப்புத்தன்மை) தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மொழிபெயர்ப்பின் மூலம் வெவ்வேறு திசுக்கள்32 மற்றும் செல்களில்33 புரத மொழிபெயர்ப்பை நேரடியாக பாதிக்கக்கூடும். எலும்புத் தசை நார்களில் இணைந்து வெளிப்படுத்தப்படும் ரைபோசோமால் புரதங்களின் துணைக்குழுக்களை அடையாளம் காண, புரோட்டியோமில் உள்ள ரைபோசோமால் புரதங்களின் மேற்பார்வையற்ற படிநிலை கொத்து பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்தோம் (படம் 3D, துணை தரவுத் தொகுப்பு 8). எதிர்பார்த்தபடி, MYH-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்டு, ரைபோசோமால் புரதங்கள் நார் வகையின்படி கொத்தாக அமையவில்லை. இருப்பினும், ரைபோசோமால் புரதங்களின் மூன்று தனித்துவமான கொத்துக்களை நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம்; முதல் கொத்து (ரைபோசோமால்_கொத்து_1) RPL38 உடன் இணைந்து கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது, எனவே நேர்மறையான PC1 சுயவிவரத்தைக் கொண்ட நார்களில் இதன் வெளிப்பாடு அதிகரித்துள்ளது. இரண்டாவது கொத்து (ரைபோசோமால்_கொத்து_2) RPS13 உடன் இணைந்து கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் எதிர்மறையான PC1 சுயவிவரத்தைக் கொண்ட நார்களில் இது அதிகமாகக் காணப்படுகிறது. மூன்றாவது தொகுப்பு (ribosomal_cluster_3) எலும்புத் தசை நார்களில் ஒருங்கிணைந்த வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டைக் காட்டவில்லை, மேலும் இது "மைய" எலும்புத் தசை ரைபோசோமல் புரதமாகக் கருதப்படலாம். ரைபோசோமல் தொகுப்புகள் 1 மற்றும் 2 ஆகிய இரண்டிலும், மாற்று மொழிபெயர்ப்பை ஒழுங்குபடுத்துவதாகவும் (எ.கா., RPL10A, RPL38, RPS19, மற்றும் RPS25) மற்றும் செயல்பாட்டு ரீதியாக வளர்ச்சியைப் பாதிப்பதாகவும் (எ.கா., RPL10A, RPL38) முன்னர் நிரூபிக்கப்பட்ட ரைபோசோமல் புரதங்கள் உள்ளன.34,35,36,37,38 PCA முடிவுகளுக்கு இணங்க, நார்கள் முழுவதும் இந்த ரைபோசோமல் புரதங்களின் காணப்பட்ட பன்முகப் பிரதிநிதித்துவமும் தொடர்ச்சியைக் காட்டியது (துணைப் படம் 7C).
ரைபோசோமிற்குள் உள்ள பன்முகத்தன்மை வாய்ந்த ரைபோசோமால் புரதங்களின் இருப்பிடத்தைக் காட்சிப்படுத்த, மனித 80S ரைபோசோமின் ஒரு கட்டமைப்பு மாதிரியை (புரதத் தரவு வங்கி: 4V6X) நாங்கள் பயன்படுத்தினோம் (படம் 3E). வெவ்வேறு ரைபோசோமால் கொத்துகளைச் சேர்ந்த ரைபோசோமால் புரதங்களைத் தனிமைப்படுத்திய பிறகு, அவற்றின் இருப்பிடங்கள் நெருக்கமாகப் பொருந்தவில்லை. இது, ரைபோசோமின் சில பகுதிகள்/பிரிவுகளுக்கு செறிவூட்டலை வழங்குவதில் எங்கள் அணுகுமுறை தோல்வியடைந்ததைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், சுவாரஸ்யமாக, கொத்து 2-இல் உள்ள பெரிய துணை அலகு புரதங்களின் விகிதம், கொத்துகள் 1 மற்றும் 3-ஐ விடக் குறைவாக இருந்தது (துணைப் படம் 7D). எலும்புத் தசை நார்களில் மாற்றப்பட்ட விகிதவியல் கொண்ட புரதங்கள் பெரும்பாலும் ரைபோசோம் மேற்பரப்பில் அமைந்திருப்பதைக் கண்டோம் (படம் 3E). இது, வெவ்வேறு mRNA தொகுதிகளில் உள்ள உள் ரைபோசோம் நுழைவுத் தள (IRES) கூறுகளுடன் தொடர்பு கொள்ளும் அவற்றின் திறனுடன் ஒத்துப்போகிறது, இதன் மூலம் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மொழிபெயர்ப்பை ஒருங்கிணைக்கிறது. 40, 41 மேலும், எலும்புத் தசை நார்களில் மாற்றப்பட்ட ஸ்டோக்கியோமெட்ரியைக் கொண்ட பல புரதங்கள், mRNA வெளியேறும் சுரங்கப்பாதை (படம் 3F) போன்ற செயல்பாட்டுப் பகுதிகளுக்கு அருகில் அமைந்திருந்தன, அவை குறிப்பிட்ட பெப்டைடுகளின் மொழிபெயர்ப்பு நீட்டிப்பு மற்றும் நிறுத்தத்தைத் தேர்ந்தெடுத்து ஒழுங்குபடுத்துகின்றன. 42 சுருக்கமாக, எலும்புத் தசை ரைபோசோமல் புரதங்களின் ஸ்டோக்கியோமெட்ரி பன்முகத்தன்மையைக் காட்டுகிறது, இதன் விளைவாக எலும்புத் தசை நார்களுக்கு இடையே வேறுபாடுகள் ஏற்படுகின்றன என்று எங்கள் தரவுகள் தெரிவிக்கின்றன.
அடுத்து, வேக மற்றும் மெது சுருக்க இழைகளின் அடையாளங்களைக் கண்டறிந்து, அவற்றின் படியெடுத்தல் ஒழுங்குமுறையின் வழிமுறைகளை ஆராய முற்பட்டோம். இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளிலும் UMAP-ஆல் வரையறுக்கப்பட்ட வேக மற்றும் மெது சுருக்க இழைக் கொத்துகளை ஒப்பிட்டுப் பார்த்ததில் (படங்கள் 1G–H மற்றும் 4A–B), படியெடுத்தல் மற்றும் புரதவியல் பகுப்பாய்வுகள் முறையே 1366 மற்றும் 804 வேறுபட்ட அளவில் காணப்படும் பண்புகளைக் கண்டறிந்தன (படங்கள் 4A–B, துணைத் தரவுத்தொகுப்புகள் 9–12). சார்க்கோமியர்கள் (எ.கா., ட்ரோபோமயோசின் மற்றும் ட்ரோபோனின்), கிளர்ச்சி-சுருக்க இணைப்பு (SERCA ஐசோஃபார்ம்கள்), மற்றும் ஆற்றல் வளர்சிதை மாற்றம் (எ.கா., ALDOA மற்றும் CKB) தொடர்பான அடையாளங்களில் எதிர்பார்க்கப்பட்ட வேறுபாடுகளை நாங்கள் கண்டறிந்தோம். மேலும், புரத யூபிகுவிடினேஷனை ஒழுங்குபடுத்தும் படியெடுத்தல்களும் புரதங்களும் வேக மற்றும் மெது சுருக்க இழைகளில் வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்டன (எ.கா., USP54, SH3RF2, USP28, மற்றும் USP48) (படங்கள் 4A–B). மேலும், முன்னர் செம்மறி ஆட்டுக்குட்டி தசை நார் வகைகளில் வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்படுவதாகக் காட்டப்பட்ட43 மற்றும் இதயத் தசைகளில் SERCA செயல்பாட்டை மேம்படுத்தும்44 நுண்ணுயிர் புரத மரபணுவான RP11-451G4.2 (DWORF), மெதுவான எலும்புத் தசை நார்களில் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகமாக வெளிப்படுத்தப்பட்டது (படம் 4A). இதேபோல், தனிப்பட்ட நார் மட்டத்தில், வளர்சிதை மாற்றம் தொடர்பான லாக்டேட் டீஹைட்ரோஜினேஸ் ஐசோஃபார்ம்கள் (LDHA மற்றும் LDHB, படம் 4C மற்றும் துணைப் படம் 8A)45,46 போன்ற அறியப்பட்ட அடையாளங்களிலும், முன்னர் அறியப்படாத நார்-வகை சார்ந்த அடையாளங்களிலும் (IRX3, USP54, USP28, மற்றும் DPYSL3 போன்றவை) குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகள் காணப்பட்டன (படம் 4C). டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் தரவுத்தொகுப்புகளுக்கு இடையில் வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட அம்சங்களில் குறிப்பிடத்தக்க ஒன்றுடன் ஒன்று சேர்தல் இருந்தது (துணைப் படம் 8B), அத்துடன் சார்க்கோமியர் அம்சங்களின் மிகவும் உச்சரிக்கப்பட்ட வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டால் முக்கியமாக இயக்கப்படும் ஒரு மடங்கு மாற்றத் தொடர்பும் இருந்தது (துணைப் படம் 8C). குறிப்பாக, சில சிக்னேச்சர்கள் (எ.கா. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) புரோட்டியோமிக் மட்டத்தில் மட்டுமே வலுவான படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய ஒழுங்குமுறையைக் காட்டின, மேலும் மெதுவான/வேகமான ட்விச் ஃபைபர் வகை சார்ந்த வெளிப்பாட்டு சுயவிவரங்களைக் கொண்டிருந்தன (துணைப் படம் 8C).
படம் 1G–H-இல் உள்ள சீரான பன்மடி தோராயமாக்கல் மற்றும் வீச்சு (UMAP) வரைபடங்களால் அடையாளம் காணப்பட்ட மெதுவான மற்றும் வேகமான கொத்துக்களை ஒப்பிடும் A மற்றும் B எரிமலை வரைபடங்கள். வண்ணப் புள்ளிகள் FDR < 0.05-இல் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுள்ள டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் அல்லது புரதங்களைக் குறிக்கின்றன, மற்றும் அடர் புள்ளிகள் log change > 1-இல் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுள்ள டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் அல்லது புரதங்களைக் குறிக்கின்றன. இருவழிப் புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வானது, பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்யப்பட்ட p மதிப்புகளுடன் கூடிய DESeq2 வால்ட் சோதனையைப் (டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ்) பயன்படுத்தியோ அல்லது பல ஒப்பீடுகளுக்கான பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்தலைத் தொடர்ந்து அனுபவ ரீதியான பேய்சியன் பகுப்பாய்வுடன் கூடிய லிம்மா நேரியல் மாதிரி முறையைப் (புரோட்டியோமிக்ஸ்) பயன்படுத்தியோ செய்யப்பட்டது. C மெதுவான மற்றும் வேகமான இழைகளுக்கு இடையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வேறுபட்ட வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்கள் அல்லது புரதங்களின் கையொப்ப வரைபடங்கள். D குறிப்பிடத்தக்க வேறுபட்ட வெளிப்படுத்தப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் மற்றும் புரதங்களின் செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு. ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் மதிப்புகள் இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளிலும் செறிவூட்டப்பட்டுள்ளன, டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் மதிப்புகள் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் மட்டுமே செறிவூட்டப்பட்டுள்ளன, மற்றும் புரோட்டியோம் மதிப்புகள் புரோட்டியோமில் மட்டுமே செறிவூட்டப்பட்டுள்ளன. பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்யப்பட்ட p-மதிப்புகளுடன் கிளஸ்டர்ப்ரோஃபைலர் தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. E. SCENIC-இலிருந்து பெறப்பட்ட ஒழுங்குபடுத்தி சிறப்புத்தன்மை மதிப்பெண்கள் மற்றும் இழை வகைகளுக்கு இடையிலான வேறுபட்ட mRNA வெளிப்பாடு ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் SCENIC-ஆல் அடையாளம் காணப்பட்ட இழை வகை-சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள். F. மெதுவான மற்றும் வேகமான இழைகளுக்கு இடையில் வேறுபட்ட முறையில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகளின் விவரக்குறிப்பு.
பின்னர், வேறுபட்ட முறையில் பிரதிநிதித்துவப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்கள் மற்றும் புரதங்களின் மிகை பிரதிநிதித்துவ பகுப்பாய்வை நாங்கள் செய்தோம் (படம் 4D, துணை தரவுத் தொகுப்பு 13). இரண்டு தரவுத்தொகுப்புகளுக்கும் இடையில் வேறுபட்ட அம்சங்களுக்கான பாதை செறிவூட்டல், கொழுப்பு அமில β-ஆக்சிடேஷன் மற்றும் கீட்டோன் வளர்சிதை மாற்ற செயல்முறைகள் (மெதுவான இழைகள்), மயோஃபிலமென்ட்/தசை சுருக்கம் (முறையே வேகமான மற்றும் மெதுவான இழைகள்), மற்றும் கார்போஹைட்ரேட் சிதைவு செயல்முறைகள் (வேகமான இழைகள்) போன்ற எதிர்பார்க்கப்பட்ட வேறுபாடுகளை வெளிப்படுத்தியது. கிளைகோஜன் வளர்சிதை மாற்றத்தை ஒழுங்குபடுத்துவதாக அறியப்படும் (47) (துணை படங்கள் 8D–E) ஒழுங்குமுறை மற்றும் வினையூக்கி பாஸ்பேடேஸ் துணை அலகுகள் (PPP3CB, PPP1R3D, மற்றும் PPP1R3A) போன்ற அம்சங்களால் இயக்கப்படும் செரின்/த்ரியோனைன் புரத பாஸ்பேடேஸ் செயல்பாடும் வேகமான இழைகளில் உயர்ந்திருந்தது. வேகமான இழைகளில் செறிவூட்டப்பட்ட மற்ற பாதைகளில் புரோட்டியோமில் உள்ள செயலாக்க (P-) உடல்கள் (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (துணைப் படம் 8F), படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய ஒழுங்குமுறையில் (48) ஈடுபடக்கூடியவை, மற்றும் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமில் உள்ள படியெடுத்தல் காரணி செயல்பாடு (SREBF1, RXRG, RORA) (துணைப் படம் 8G) ஆகியவை அடங்கும். மெதுவான இழைகள் ஆக்சிடோரிடக்டேஸ் செயல்பாடு (BDH1, DCXR, TXN2) (துணைப் படம் 8H), அமைடு பிணைப்பு (CPTP, PFDN2, CRYAB) (துணைப் படம் 8I), புற உயிரணு அணி (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (துணைப் படம் 8J), மற்றும் ஏற்பி-இணைப்பி செயல்பாடு (FNDC5, SPX, NENF) (துணைப் படம் 8K) ஆகியவற்றில் செறிவூட்டப்பட்டன.
மெதுவான/வேகமான தசை நார் வகை பண்புகளுக்கு அடிப்படையான படியெடுத்தல் ஒழுங்குமுறை குறித்த மேலதிகப் புரிதலைப் பெறுவதற்காக, நாங்கள் SCENIC49-ஐப் (துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 14) பயன்படுத்தி படியெடுத்தல் காரணி செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வை மேற்கொண்டோம். வேகமான மற்றும் மெதுவான தசை நார்களுக்கு இடையில் பல படியெடுத்தல் காரணிகள் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் செறிவூட்டப்பட்டிருந்தன (படம் 4E). இதில், முன்னர் வேகமான தசை நார் வளர்ச்சியுடன் தொடர்புபடுத்தப்பட்ட MAFA போன்ற படியெடுத்தல் காரணிகளும், தசை நார் வகை-சார்ந்த மரபணுத் திட்டங்களுடன் முன்னர் தொடர்புபடுத்தப்படாத பல படியெடுத்தல் காரணிகளும் அடங்கும். இவற்றுள், PITX1, EGR1, மற்றும் MYF6 ஆகியவை வேகமான தசை நார்களில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட படியெடுத்தல் காரணிகளாக இருந்தன (படம் 4E). இதற்கு மாறாக, ZSCAN30 மற்றும் EPAS1 (HIF2A என்றும் அழைக்கப்படுகிறது) ஆகியவை மெதுவான தசை நார்களில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட படியெடுத்தல் காரணிகளாக இருந்தன (படம் 4E). இதற்கு இணங்க, வேகமான தசை நார்களுக்குரிய UMAP பகுதியில் MAFA அதிக அளவில் வெளிப்படுத்தப்பட்டது, அதேசமயம் EPAS1 இதற்கு நேர்மாறான வெளிப்பாட்டு முறையைக் கொண்டிருந்தது (படம் 4F).
அறியப்பட்ட புரத-குறியீட்டு மரபணுக்களுக்கு கூடுதலாக, மனித வளர்ச்சி மற்றும் நோயின் ஒழுங்குமுறையில் ஈடுபடக்கூடிய ஏராளமான குறியீடற்ற ஆர்.என்.ஏ உயிரி வகைகள் உள்ளன. 51, 52 டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் தரவுத்தொகுப்புகளில், பல குறியீடற்ற ஆர்.என்.ஏ-க்கள் இழை வகை பிரத்தியேகத்தன்மையை வெளிப்படுத்துகின்றன (படம் 5A மற்றும் துணை தரவுத்தொகுப்பு 15), மெதுவான இழைகளுக்கு மிகவும் பிரத்தியேகமானதும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் மயோபதி நோயாளிகளின் தசைகளில் குறைந்து காணப்படுவதாகக் கூறப்படுவதுமான LINC01405 உட்பட. 53 இதற்கு மாறாக, lnc-ERCC5-5 மரபணுவிற்கு (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 தொடர்புடைய RP11-255P5.3, வேகமான இழை வகை பிரத்தியேகத்தன்மையை வெளிப்படுத்துகிறது. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) மற்றும் RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) ஆகிய இரண்டும் எலும்புத் தசைக்கான பிரத்யேகத் தன்மையைக் காட்டுகின்றன (துணைப் படங்கள் 9A–B). மேலும், அவற்றின் 1 Mb மரபணுப் பகுதிக்குள் அறியப்பட்ட சுருங்கும் மரபணுக்கள் எதுவும் இல்லை. இது, அவை அருகிலுள்ள சுருங்கும் மரபணுக்களை ஒழுங்குபடுத்துவதை விட, தசை நார் வகைகளை ஒழுங்குபடுத்துவதில் ஒரு சிறப்புப் பங்கை வகிக்கின்றன என்பதைக் காட்டுகிறது. LINC01405 மற்றும் RP11-255P5.3 ஆகியவற்றின் மெதுவான/வேகமான தசை நார் வகை சார்ந்த வெளிப்பாட்டு விவரங்கள், RNAscope-ஐப் பயன்படுத்தி முறையே உறுதி செய்யப்பட்டன (படங்கள் 5B–C).
A. குறியீடற்ற ஆர்.என்.ஏ படியெடுத்தல்கள், மெது மற்றும் வேகத் துடிப்புத் தசை நார்களில் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் ஒழுங்குபடுத்தப்படுகின்றன. B. முறையே LINC01405 மற்றும் RP11-255P5.3 ஆகியவற்றின் மெது மற்றும் வேகத் துடிப்புத் தசை நார் வகை சார்ந்த தனித்தன்மையைக் காட்டும் பிரதிநிதித்துவ ஆர்.என்.ஏஸ்கோப் படங்கள். அளவுகோல் = 50 μm. C. ஆர்.என்.ஏஸ்கோப் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்ட தசை நார் வகை சார்ந்த குறியீடற்ற ஆர்.என்.ஏ வெளிப்பாட்டின் அளவு நிர்ணயம் (தனிப்பட்ட நபர்களிடமிருந்து பெறப்பட்ட 3 திசு மாதிரிகள், ஒவ்வொரு தனிநபருக்குள்ளும் உள்ள வேக மற்றும் மெது தசை நார்களை ஒப்பிடுதல்). புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வு இரு-முனை ஸ்டூடண்ட்ஸ் t-சோதனையைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது. பெட்டி வரைபடங்கள் இடைநிலை மற்றும் முதல் மற்றும் மூன்றாம் கால்மானங்களைக் காட்டுகின்றன, மீசைக்கோடுகள் குறைந்தபட்ச மற்றும் அதிகபட்ச மதிப்புகளைச் சுட்டிக்காட்டுகின்றன. D. புதிதாக நுண்ணுயிரி புரதத்தை அடையாளம் காணும் பணிப்பாய்வு (BioRender.com மூலம் உருவாக்கப்பட்டது). E. LINC01405_ORF408:17441:17358 என்ற நுண்ணுயிர்ப் புரதமானது, மெதுவான எலும்புத் தசை நார்களில் பிரத்தியேகமாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது (தனிப்பட்ட பங்கேற்பாளர்களிடமிருந்து பெறப்பட்ட 5 திசு மாதிரிகள்; ஒவ்வொரு பங்கேற்பாளரின் வேகமான மற்றும் மெதுவான தசை நார்களை ஒப்பிடுதல்). புள்ளியியல் பகுப்பாய்வானது, அனுபவ ரீதியான பேய்சியன் அணுகுமுறையுடன் இணைக்கப்பட்ட லிம் நேரியல் மாதிரி முறையைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது; அதனைத் தொடர்ந்து, p-மதிப்பு சரிசெய்தலுடன் கூடிய பல ஒப்பீடுகளுக்காக பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் முறை பயன்படுத்தப்பட்டது. பெட்டி வரைபடங்கள் இடைநிலை, முதல் மற்றும் மூன்றாம் கால்மானங்களைக் காட்டுகின்றன; இவற்றில் மீசைக்கோடுகள் அதிகபட்ச/குறைந்தபட்ச மதிப்புகளைச் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.
சமீபத்தில், பல அனுமானிக்கப்பட்ட குறியீடற்ற டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள், படியெடுக்கப்பட்ட நுண்ணுயிர் புரதங்களைக் குறியீடு செய்கின்றன என்றும், அவற்றில் சில தசை செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்துகின்றன என்றும் ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன. 44, 55 சாத்தியமான இழை வகை பிரத்தியேகத்தன்மை கொண்ட நுண்ணுயிர் புரதங்களைக் கண்டறிய, 1000 இழை டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் தரவுத்தொகுப்பில் காணப்படும் குறியீடற்ற டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் (n = 305) வரிசைகளைக் கொண்ட ஒரு தனிப்பயன் FASTA கோப்பைப் பயன்படுத்தி, எங்களின் 1000 இழை புரோட்டியோம் தரவுத்தொகுப்பில் தேடினோம் (படம் 5D). 22 வெவ்வேறு டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளிலிருந்து 197 நுண்ணுயிர் புரதங்களை நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம், அவற்றில் 71 மெதுவான மற்றும் வேகமான எலும்புத் தசை இழைகளுக்கு இடையில் வேறுபட்ட முறையில் ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டன (துணைப் படம் 9C மற்றும் துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 16). LINC01405-க்கு, மூன்று நுண்ணுயிர் புரத விளைபொருட்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன, அவற்றில் ஒன்று அதன் டிரான்ஸ்கிரிப்டைப் போலவே மெதுவான இழை பிரத்தியேகத்தன்மையைக் காட்டியது (படம் 5E மற்றும் துணைப் படம் 9D). இவ்வாறு, LINC01405-ஐ மெதுவான எலும்புத் தசை இழைகளுக்கு பிரத்தியேகமான ஒரு நுண்ணுயிர் புரதத்தைக் குறியீடு செய்யும் மரபணுவாக நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம்.
தனிப்பட்ட தசை நார்களின் பெரிய அளவிலான புரோட்டியோமிக் பண்புகளைக் கண்டறிவதற்கான ஒரு விரிவான பணிப்பாய்வை நாங்கள் உருவாக்கினோம், மேலும் ஆரோக்கியமான நிலைகளில் தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மையைக் கட்டுப்படுத்தும் காரணிகளையும் அடையாளம் கண்டோம். நெமலைன் மயோபதிகள் எலும்புத் தசை நார்களின் பன்முகத்தன்மையை எவ்வாறு பாதிக்கின்றன என்பதைப் புரிந்துகொள்ள, இந்தப் பணிப்பாய்வை நாங்கள் பயன்படுத்தினோம். நெமலைன் மயோபதிகள் என்பவை பரம்பரையாக வரும் தசை நோய்களாகும். இவை தசை பலவீனத்தை ஏற்படுத்துவதோடு, பாதிக்கப்பட்ட குழந்தைகளில் சுவாசக் கோளாறு, ஸ்கோலியோசிஸ் மற்றும் குறைந்த கை, கால் அசைவுத்திறன் உள்ளிட்ட பல்வேறு சிக்கல்களையும் வெளிப்படுத்துகின்றன. 19,20 பொதுவாக, நெமலைன் மயோபதிகளில், ஆக்டின் ஆல்பா 1 (ACTA1) போன்ற மரபணுக்களில் உள்ள நோய்க்கிருமி மாறுபாடுகள், மெதுவாகச் சுருங்கும் தசை நார்களின் கலவை மேலோங்குவதற்கு வழிவகுக்கின்றன, இருப்பினும் இந்த விளைவு பன்முகத்தன்மை வாய்ந்தது. இதற்கு ஒரு குறிப்பிடத்தக்க விதிவிலக்கு ட்ரோபோனின் T1 நெமலைன் மயோபதி (TNNT1) ஆகும், இதில் வேகமாகச் சுருங்கும் தசை நார்கள் மேலோங்கி இருக்கும். எனவே, நெமலைன் மயோபதிகளில் காணப்படும் எலும்புத் தசை நார்களின் ஒழுங்கின்மைக்கு அடிப்படையாக உள்ள பன்முகத்தன்மையை நன்கு புரிந்துகொள்வது, இந்த நோய்களுக்கும் தசை நார்களின் வகைக்கும் இடையிலான சிக்கலான உறவை வெளிக்கொணர உதவக்கூடும்.
ஆரோக்கியமான கட்டுப்பாட்டுக் குழுவினருடன் (ஒவ்வொரு குழுவிலும் n=3) ஒப்பிடுகையில், ACTA1 மற்றும் TNNT1 மரபணுக்களில் பிறழ்வுகளைக் கொண்ட நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளிடமிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட தசை நார்கள், குறிப்பிடத்தக்க தசை நார் சிதைவு அல்லது தசைச் சிதைவைக் காட்டின (படம் 6A, துணை அட்டவணை 3). கிடைக்கக்கூடிய பொருளின் அளவு குறைவாக இருந்ததால், இது புரதவியல் பகுப்பாய்விற்கு குறிப்பிடத்தக்க தொழில்நுட்ப சவால்களை முன்வைத்தது. இருந்தபோதிலும், 272 எலும்புத் தசை நார்களில் 2485 புரதங்களை எங்களால் கண்டறிய முடிந்தது. ஒரு தசை நாருக்குக் குறைந்தது 1000 அளவிடப்பட்ட புரதங்களை வடிகட்டிய பிறகு, 250 தசை நார்கள் அடுத்தடுத்த உயிரித் தகவல் பகுப்பாய்விற்கு உட்படுத்தப்பட்டன. வடிகட்டிய பிறகு, ஒரு தசை நாருக்கு சராசரியாக 1573 ± 359 புரதங்கள் அளவிடப்பட்டன (துணைப் படம் 10A, துணைத் தரவுத் தொகுப்புகள் 17–18). குறிப்பிடத்தக்க வகையில், தசை நாரின் அளவில் கணிசமான குறைப்பு இருந்தபோதிலும், நெமலைன் மயோபதி நோயாளி மாதிரிகளின் புரதத்தொகுப்பின் ஆழம் மிதமாக மட்டுமே குறைக்கப்பட்டது. மேலும், எங்களின் சொந்த FASTA கோப்புகளைப் (குறியீடற்ற படியெடுத்தல்கள் உட்பட) பயன்படுத்தி இந்தத் தரவுகளைச் செயலாக்கியதன் மூலம், நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளின் எலும்புத் தசை நார்களில் உள்ள ஐந்து நுண்ணுயிர்ப் புரதங்களை எங்களால் அடையாளம் காண முடிந்தது (துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 19). புரோட்டியோமின் இயக்க வரம்பு குறிப்பிடத்தக்க அளவில் பரந்ததாக இருந்தது, மேலும் கட்டுப்பாட்டுக் குழுவில் உள்ள மொத்தப் புரதங்கள், முந்தைய 1000-நார் புரோட்டியோம் பகுப்பாய்வின் முடிவுகளுடன் நன்கு ஒத்துப்போயின (துணைப் படம் 10B–C).
A. ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதிகளில் (NM) MYH-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்டு, தசை நார் சிதைவு அல்லது சீர்குலைவு மற்றும் வெவ்வேறு தசை நார் வகைகளின் ஆதிக்கத்தைக் காட்டும் நுண்ணோக்கிப் படங்கள். அளவுப் பட்டை = 100 μm. ACTA1 மற்றும் TNNT1 நோயாளிகளிடம் சாயமேற்றலின் மீள் உருவாக்கத்தை உறுதி செய்வதற்காக, பிரதிநிதித்துவப் படங்களைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்கு முன்பு, மூன்று நோயாளி திசு மாதிரிகள் இரண்டு முதல் மூன்று முறை (ஒரு நோயாளிக்கு நான்கு பிரிவுகள்) சாயமேற்றப்பட்டன. B. MYH-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்டு பங்கேற்பாளர்களிடம் உள்ள தசை நார் வகை விகிதாச்சாரங்கள். C. நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகள் மற்றும் கட்டுப்பாட்டுக் குழுவினரின் எலும்புத் தசை நார்களின் முதன்மைக் கூறுப் பகுப்பாய்வு (PCA) வரைபடம். D. படம் 2-இல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட 1000 தசை நார்களிலிருந்து தீர்மானிக்கப்பட்ட ஒரு PCA வரைபடத்தில், நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகள் மற்றும் கட்டுப்பாட்டுக் குழுவினரின் எலும்புத் தசை நார்கள் பதிக்கப்பட்டுள்ளன. எடுத்துக்காட்டாக, ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளுக்கும் கட்டுப்பாட்டுக் குழுவினருக்கும் இடையிலான வேறுபாடுகளையும், ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளுக்கிடையிலான வேறுபாடுகளையும் ஒப்பிடும் எரிமலை வரைபடங்கள். வண்ண வட்டங்கள் π < 0.05 அளவில் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு கொண்ட புரதங்களையும், அடர் புள்ளிகள் FDR < 0.05 அளவில் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு கொண்ட புரதங்களையும் குறிக்கின்றன. புள்ளியியல் பகுப்பாய்வானது லிம்மா நேரியல் மாதிரி முறை மற்றும் அனுபவ ரீதியான பேய்சியன் முறைகளைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது, அதனைத் தொடர்ந்து பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் முறையைப் பயன்படுத்தி பல ஒப்பீடுகளுக்கான p-மதிப்பு சரிசெய்தல் செய்யப்பட்டது. H. முழு புரோட்டியோம் மற்றும் வகை 1 மற்றும் 2A இழைகளில் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டைக் கொண்ட புரதங்களின் செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு. புள்ளியியல் பகுப்பாய்வானது clusterProfiler தொகுப்பு மற்றும் பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் சரிசெய்யப்பட்ட p-மதிப்புகளைப் பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது. I, J. புற உயிரணு அணி மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணு ஆன்காலஜி (GO) சொற்களால் வண்ணமிடப்பட்ட முதன்மைக் கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) வரைபடங்கள்.
நெமலைன் மயோபதிகள் எலும்புத் தசைகளில் MYH-ஐ வெளிப்படுத்தும் தசைநார் வகைகளின் விகிதத்தைப் பாதிக்கக்கூடும் என்பதால்,¹⁹,²⁰ நாங்கள் முதலில் நெமலைன் மயோபதிகள் உள்ள நோயாளிகள் மற்றும் கட்டுப்பாட்டுக் குழுவினரிடம் MYH-ஐ வெளிப்படுத்தும் தசைநார் வகைகளை ஆய்வு செய்தோம். 1000 தசைநார் சோதனைக்காக முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட ஒரு பாரபட்சமற்ற முறையைப் பயன்படுத்தி தசைநார் வகையை நாங்கள் தீர்மானித்தோம் (துணைப் படங்கள் 10D–E), மீண்டும் தூய 2X தசைநார்களை அடையாளம் காணத் தவறினோம் (படம் 6B). தசைநார் வகையின் மீது நெமலைன் மயோபதிகளின் ஒரு சீரற்ற விளைவை நாங்கள் கண்டறிந்தோம், ஏனெனில் ACTA1 பிறழ்வுகள் கொண்ட இரண்டு நோயாளிகளிடம் வகை 1 தசைநார்களின் விகிதம் அதிகரித்திருந்தது, அதேசமயம் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி கொண்ட இரண்டு நோயாளிகளிடம் வகை 1 தசைநார்களின் விகிதம் குறைந்திருந்தது (படம் 6B). உண்மையில், ACTA1-நெமலைன் மயோபதிகளில் MYH2 மற்றும் ஃபாஸ்ட் ட்ரோபோனின் ஐசோஃபார்ம்களின் (TNNC2, TNNI2, மற்றும் TNNT3) வெளிப்பாடு குறைந்திருந்தது, அதேசமயம் TNNT1-நெமலைன் மயோபதிகளில் MYH7 வெளிப்பாடு குறைந்திருந்தது (துணைப் படம் 11A). இது நெமலைன் மயோபதிகளில் காணப்படும் பன்முகத்தன்மை வாய்ந்த மயோஃபைபர் வகை மாறுதல் குறித்த முந்தைய அறிக்கைகளுடன் ஒத்துப்போகிறது.¹⁹,²⁰ இந்த முடிவுகளை நாங்கள் இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிஸ்ட்ரி மூலம் உறுதிப்படுத்தினோம், மேலும் ACTA1-நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளிடம் வகை 1 மயோஃபைபர்கள் அதிகமாக இருப்பதையும், அதேசமயம் TNNT1-நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளிடம் இதற்கு நேர்மாறான அமைப்பு இருப்பதையும் கண்டறிந்தோம் (படம் 6A).
ஒற்றை-இழை புரோட்டியோம் மட்டத்தில், ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளின் எலும்புத் தசை இழைகள் பெரும்பாலான கட்டுப்பாட்டு இழைகளுடன் குழுவாக அமைந்தன, மேலும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி இழைகள் பொதுவாக மிகவும் கடுமையாகப் பாதிக்கப்பட்டிருந்தன (படம் 6C). ஒவ்வொரு நோயாளிக்கும் போலி-வீங்கிய இழைகளின் முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) வரைபடங்களை வரையும்போது இது குறிப்பாகத் தெளிவாகத் தெரிந்தது, இதில் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகள் 2 மற்றும் 3 கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகளிலிருந்து மிகவும் தொலைவில் தோன்றினர் (துணைப் படம் 11B, துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 20). மயோபதி நோயாளிகளின் இழைகள் ஆரோக்கியமான இழைகளுடன் எவ்வாறு ஒப்பிடுகின்றன என்பதை நன்கு புரிந்துகொள்ள, ஆரோக்கியமான வயது வந்த பங்கேற்பாளர்களிடமிருந்து 1,000 இழைகளின் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட விரிவான தகவல்களைப் பயன்படுத்தினோம். மயோபதி தரவுத்தொகுப்பிலிருந்து (ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகள்) இழைகளை 1000-இழை புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட PCA வரைபடத்தில் நாங்கள் திட்டமிட்டோம் (படம் 6D). கட்டுப்பாட்டு இழைகளில் PC2 நெடுகிலும் MYH இழை வகைகளின் பரவல், 1000-இழை புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட இழைப் பரவலை ஒத்திருந்தது. இருப்பினும், நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளில் பெரும்பாலான இழைகள், அவற்றின் இயல்பான MYH இழை வகையைப் பொருட்படுத்தாமல், PC2 நெடுகிலும் கீழ்நோக்கி நகர்ந்து, ஆரோக்கியமான வேகத் துடிப்பு இழைகளுடன் மேற்பொருந்தின. இவ்வாறு, MYH-அடிப்படையிலான முறைகளைப் பயன்படுத்தி அளவிடும்போது ACTA1 நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகள் வகை 1 இழைகளை நோக்கிய நகர்வைக் காட்டினாலும், ACTA1 நெமலைன் மயோபதி மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி ஆகிய இரண்டுமே எலும்புத் தசை இழை புரோட்டியோமை வேகத் துடிப்பு இழைகளை நோக்கி நகர்த்தின.
பின்னர் நாங்கள் ஒவ்வொரு நோயாளி குழுவையும் ஆரோக்கியமான கட்டுப்பாட்டுக் குழுக்களுடன் நேரடியாக ஒப்பிட்டு, ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதிகளில் முறையே 256 மற்றும் 552 வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டுப் புரதங்களைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 6E–G மற்றும் துணைப் படம் 11C, துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 21). மரபணு செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதங்களில் ஒரு ஒருங்கிணைந்த குறைவைக் காட்டியது (படம் 6H–I, துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 22). ஆச்சரியப்படும் விதமாக, ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதிகளில் தசை நார் வகைகளின் வேறுபட்ட ஆதிக்கம் இருந்தபோதிலும், இந்தக் குறைவானது MYH-அடிப்படையிலான தசை நார் வகையைச் சாராததாக இருந்தது (படம் 6H மற்றும் துணைப் படங்கள் 11D–I, துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 23). ACTA1 அல்லது TNNT1 நெமலைன் மயோபதிகளில் மூன்று நுண்ணுயிர்ப் புரதங்களும் ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டன. இந்த மைக்ரோபுரோட்டீன்களில் இரண்டான, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 அல்லது Lnc-FOXO1 என்றும் அழைக்கப்படுகிறது) மற்றும் ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), வகை 1 மயோஃபைபர்களில் மட்டுமே வேறுபட்ட செறிவைக் காட்டின. ENSG00000215483_TR14_ORF67, செல் சுழற்சி ஒழுங்குமுறையில் ஒரு பங்கைக் கொண்டிருப்பதாக முன்னர் அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது. 56 மறுபுறம், ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798-க்கு இணையானது), ஆரோக்கியமான கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது ACTA1-நெமலைன் மயோபதியில் வகை 1 மற்றும் வகை 2A ஆகிய இரண்டு மயோஃபைபர்களிலும் அதிகரித்துக் காணப்பட்டது (துணைப் படம் 12A, துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 24). இதற்கு மாறாக, நெமலைன் மயோபதியால் ரைபோசோமல் புரதங்கள் பெருமளவில் பாதிக்கப்படவில்லை, இருப்பினும் ACTA1 நெமலைன் மயோபதியில் RPS17-ன் அளவு குறைந்திருந்தது (படம் 6E).
செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வானது, ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதிகளில் நோயெதிர்ப்பு மண்டல செயல்முறைகள் அதிகரித்திருப்பதையும், அதே நேரத்தில் TNNT1 நெமலைன் மயோபதியில் செல் ஒட்டுதலும் அதிகரித்திருப்பதையும் வெளிப்படுத்தியது (படம் 6H). இந்த புறக் காரணிகளின் செறிவூட்டலானது, புற அணிப் புரதங்கள் PC1 மற்றும் PC2-வில் PCA-வை ஒரு எதிர்மறை திசையில் (அதாவது, மிகவும் பாதிக்கப்பட்ட இழைகளை நோக்கி) நகர்த்துவதன் மூலம் பிரதிபலித்தது (படம் 6J). இரண்டு நோயாளி குழுக்களும், நோயெதிர்ப்புத் துலங்கல்கள் மற்றும் சர்கோலெம்மல் பழுதுபார்க்கும் வழிமுறைகளில் ஈடுபட்டுள்ள புறக் புரதங்களான அனெக்சின்கள் (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 மற்றும் அவற்றுடன் இடைவினைபுரியும் புரதமான S100A1159 ஆகியவற்றின் அதிகரித்த வெளிப்பாட்டைக் காட்டின (துணைப் படங்கள் 12B–C). இந்த செயல்முறை தசைச் சிதைவு நோய்களில்60 மேம்படுத்தப்பட்டிருப்பதாக முன்னர் அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது, ஆனால், எங்களுக்குத் தெரிந்தவரை, இது முன்னர் நெமலைன் மயோபதிகளுடன் தொடர்புபடுத்தப்படவில்லை. காயத்திற்குப் பிறகு சர்கோலெம்மல் பழுதுபார்ப்பதற்கும், புதிதாக உருவான மயோசைட்டுகள் மயோஃபைபர்களுடன் இணைவதற்கும் இந்த மூலக்கூறு இயந்திரத்தின் இயல்பான செயல்பாடு தேவைப்படுகிறது58,61. எனவே, இரண்டு நோயாளி குழுக்களிலும் இந்த செயல்முறையின் அதிகரித்த செயல்பாடு, மயோஃபைபர் உறுதியற்ற தன்மையால் ஏற்படும் காயத்திற்கு ஒரு பழுதுபார்க்கும் பதிலைக் குறிக்கிறது.
ஒவ்வொரு நெமலைன் மயோபதியின் விளைவுகளும் நன்கு தொடர்புபடுத்தப்பட்டு (r = 0.736) மற்றும் நியாயமான ஒன்றுடன் ஒன்று பொருந்துதலைக் காட்டின (துணைப் படங்கள் 11A–B), இது ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி ஆகியவை புரோட்டியோம் மீது ஒத்த விளைவுகளைக் கொண்டிருப்பதைக் குறிக்கிறது. இருப்பினும், சில புரதங்கள் ACTA1 அல்லது TNNT1 நெமலைன் மயோபதியில் மட்டுமே ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டன (துணைப் படங்கள் 11A மற்றும் C). ஃபைப்ரோடிக் புரதமான MFAP4, TNNT1 நெமலைன் மயோபதியில் மிகவும் அதிகமாக ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட புரதங்களில் ஒன்றாக இருந்தது, ஆனால் ACTA1 நெமலைன் மயோபதியில் மாற்றமின்றி இருந்தது. HOX மரபணு படியெடுத்தலை ஒழுங்குபடுத்துவதற்குப் பொறுப்பான PAF1C தொகுப்பின் ஒரு அங்கமான SKIC8, TNNT1 நெமலைன் மயோபதியில் குறைவாக ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டது, ஆனால் ACTA1 நெமலைன் மயோபதியில் பாதிக்கப்படவில்லை (துணைப் படம் 11A). ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதியை நேரடியாக ஒப்பிட்டுப் பார்த்ததில், TNNT1 நெமலைன் மயோபதியில் மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதங்கள் அதிக அளவில் குறைந்திருப்பதும், நோயெதிர்ப்பு மண்டலப் புரதங்கள் அதிகரித்திருப்பதும் தெரியவந்தது (படம் 6G–H மற்றும் துணைப் படங்கள் 11C மற்றும் 11H–I). இந்தத் தரவுகள், TNNT1 நெமலைன் மயோபதியுடன் ஒப்பிடும்போது ACTA1 நெமலைன் மயோபதியில் காணப்படும் அதிகப்படியான தசைச் சிதைவு/தசைச் சிதைவுடன் ஒத்துப்போகின்றன (படம் 6A). இது, TNNT1 நெமலைன் மயோபதியானது இந்நோயின் மிகவும் கடுமையான ஒரு வடிவத்தைக் குறிக்கிறது என்பதைச் சுட்டிக்காட்டுகிறது.
நெமலைன் மயோபதியின் கவனிக்கப்பட்ட விளைவுகள் முழுத் தசை மட்டத்திலும் நீடிக்கின்றனவா என்பதை மதிப்பிடுவதற்கு, TNNT1 நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளின் அதே குழுவிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட தசைத் திசு மாதிரிகளின் மொத்தப் புரதவியல் பகுப்பாய்வை நாங்கள் மேற்கொண்டோம், மேலும் அவற்றை கட்டுப்பாட்டுக் குழுவுடன் (ஒரு குழுவிற்கு n=3) ஒப்பிட்டோம் (துணைப் படம் 13A, துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 25). எதிர்பார்த்தபடி, முதன்மைக் கூறுப் பகுப்பாய்வில் கட்டுப்பாட்டுக் குழுவினர் நெருங்கிய தொடர்புடையவர்களாக இருந்தனர், அதேசமயம் TNNT1 நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகள், ஒற்றை இழைப் பகுப்பாய்வில் காணப்பட்டதைப் போன்ற அதிக மாதிரிகளுக்கிடையேயான மாறுபாட்டைக் காட்டினர் (துணைப் படம் 13B). மொத்தப் பகுப்பாய்வானது, தனிப்பட்ட இழைகளை ஒப்பிடுவதன் மூலம் முன்னிலைப்படுத்தப்பட்ட வேறுபட்ட வெளிப்படுத்தப்பட்ட புரதங்களையும் (துணைப் படம் 13C, துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 26) மற்றும் உயிரியல் செயல்முறைகளையும் (துணைப் படம் 13D, துணைத் தரவுத் தொகுப்பு 27) மீண்டும் உருவாக்கியது, ஆனால் வெவ்வேறு இழை வகைகளுக்கு இடையில் வேறுபடுத்தும் திறனை இழந்தது மற்றும் இழைகள் முழுவதும் உள்ள சீரற்ற நோய் விளைவுகளைக் கணக்கில் கொள்ளத் தவறியது.
ஒட்டுமொத்தமாக, இந்தத் தரவுகள், இம்யூனோபிளாட்டிங் போன்ற இலக்கு முறைகளால் கண்டறிய முடியாத மருத்துவ உயிரியல் அம்சங்களை ஒற்றைத் தசைநார் புரோட்டியோமிக்ஸ் தெளிவுபடுத்த முடியும் என்பதை நிரூபிக்கின்றன. மேலும், புறத்தோற்றத் தழுவலை விவரிக்க ஆக்டின் இழை வகைப்படுத்தலை (MYH) மட்டும் பயன்படுத்துவதில் உள்ள வரம்புகளை இந்தத் தரவுகள் எடுத்துக்காட்டுகின்றன. உண்மையில், ஆக்டின் மற்றும் ட்ரோபோனின் நெமலைன் தசை நோய்களுக்கு இடையில் இழை வகை மாறுதல் வேறுபட்டாலும், இவ்விரு நெமலைன் தசை நோய்களுமே, வேகமான மற்றும் குறைந்த ஆக்சிஜனேற்றத் தசைப் புரோட்டியோமை நோக்கி, MYH இழை வகைப்படுத்தலை எலும்புத் தசை இழை வளர்சிதை மாற்றத்திலிருந்து பிரிக்கின்றன.
திசுக்கள் தங்களின் பல்வேறு தேவைகளைப் பூர்த்தி செய்வதற்கு, செல்களின் பன்முகத்தன்மை இன்றியமையாதது. எலும்புத் தசைகளில், இது பெரும்பாலும் வெவ்வேறு அளவிலான விசை உற்பத்தி மற்றும் சோர்வுறும் தன்மையைக் கொண்ட இழை வகைகளாக விவரிக்கப்படுகிறது. இருப்பினும், இது எலும்புத் தசை இழை மாறுபாட்டின் ஒரு சிறிய பகுதியை மட்டுமே விளக்குகிறது என்பது தெளிவாகிறது; இந்த மாறுபாடு முன்பு நினைத்ததை விட மிகவும் மாறுபட்டதாகவும், சிக்கலானதாகவும், பன்முகத்தன்மை கொண்டதாகவும் உள்ளது. தொழில்நுட்ப முன்னேற்றங்கள் இப்போது எலும்புத் தசை இழைகளை ஒழுங்குபடுத்தும் காரணிகள் மீது வெளிச்சம் பாய்ச்சியுள்ளன. உண்மையில், வகை 2X இழைகள் ஒரு தனித்துவமான எலும்புத் தசை இழை துணை வகையாக இருக்காது என்று எங்கள் தரவுகள் தெரிவிக்கின்றன. மேலும், வளர்சிதை மாற்றப் புரதங்கள், ரைபோசோமால் புரதங்கள் மற்றும் செல்-சார்ந்த புரதங்கள் ஆகியவற்றை எலும்புத் தசை இழை பன்முகத்தன்மையின் முக்கிய நிர்ணயிகளாக நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம். நூற்புழு தசை நோயால் பாதிக்கப்பட்ட நோயாளிகளின் மாதிரிகளில் எங்கள் புரோட்டியோமிக் பணிப்பாய்வைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், MYH-அடிப்படையிலான இழை வகைப்பாடு, குறிப்பாக அமைப்பு சீர்குலைந்திருக்கும்போது, ​​எலும்புத் தசை பன்முகத்தன்மையை முழுமையாகப் பிரதிபலிக்கவில்லை என்பதை நாங்கள் மேலும் நிரூபித்தோம். உண்மையில், MYH-அடிப்படையிலான இழை வகையைப் பொருட்படுத்தாமல், நூற்புழு தசை நோயானது வேகமான மற்றும் குறைந்த ஆக்சிஜனேற்ற இழைகளை நோக்கிய ஒரு மாற்றத்தை ஏற்படுத்துகிறது.
எலும்புத் தசை நார்கள் 19 ஆம் நூற்றாண்டு முதல் வகைப்படுத்தப்பட்டு வருகின்றன. சமீபத்திய ஓமிக்ஸ் பகுப்பாய்வுகள், வெவ்வேறு MYH நார் வகைகளின் வெளிப்பாட்டு விவரங்களையும், பல்வேறு தூண்டுதல்களுக்கு அவற்றின் எதிர்வினைகளையும் புரிந்துகொள்ளத் தொடங்க நமக்கு உதவியுள்ளன. இங்கு விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, ஒரு எலும்புத் தசை நார் வகையை வரையறுக்க ஒற்றை (அல்லது சில) குறிப்பான்களின் அளவீட்டைச் சார்ந்திருக்காமல், பாரம்பரிய ஆன்டிபாடி அடிப்படையிலான முறைகளை விட நார் வகை குறிப்பான்களை அளவிடுவதில் அதிக உணர்திறன் என்ற நன்மையையும் ஓமிக்ஸ் அணுகுமுறைகள் கொண்டுள்ளன. மனித எலும்புத் தசை நார்களில் உள்ள நார் பன்முகத்தன்மையின் படியெடுத்தல் மற்றும் படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய ஒழுங்குமுறையை ஆராய்வதற்காக, நாங்கள் நிரப்பு டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பணிப்பாய்வுகளைப் பயன்படுத்தி, அதன் முடிவுகளை ஒருங்கிணைத்தோம். இந்தப் பணிப்பாய்வின் விளைவாக, எங்களின் ஆரோக்கியமான இளம் ஆண்கள் குழுவின் வாஸ்டஸ் லேட்டராலிஸ் தசையில், புரத மட்டத்தில் தூய 2X-வகை நார்களை அடையாளம் காண முடியவில்லை. ஆரோக்கியமான வாஸ்டஸ் லேட்டராலிஸ் தசையில் <1% தூய 2X நார்களைக் கண்டறிந்த முந்தைய ஒற்றை நார் ஆய்வுகளுடன் இது ஒத்துப்போகிறது, இருப்பினும் இது எதிர்காலத்தில் மற்ற தசைகளிலும் உறுதிப்படுத்தப்பட வேண்டும். mRNA மட்டத்தில் ஏறக்குறைய தூய 2X இழைகளைக் கண்டறிவதற்கும், புரத மட்டத்தில் கலப்பு 2A/2X இழைகளை மட்டுமே கண்டறிவதற்கும் இடையே உள்ள முரண்பாடு குழப்பத்தை ஏற்படுத்துகிறது. MYH ஐசோஃபார்ம் mRNA வெளிப்பாடு தினசரி சுழற்சி முறையில் அமைவதில்லை,67 இது RNA மட்டத்தில் வெளித்தோற்றத்தில் தூய 2X இழைகளில் MYH2 தொடக்க சமிக்ஞையை நாம் "தவறவிட்டிருக்க" வாய்ப்பில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. முற்றிலும் கருதுகோளாக இருந்தாலும், ஒரு சாத்தியமான விளக்கம், MYH ஐசோஃபார்ம்களுக்கு இடையே புரதம் மற்றும்/அல்லது mRNA நிலைத்தன்மையில் உள்ள வேறுபாடுகளாக இருக்கலாம். உண்மையில், எந்தவொரு MYH ஐசோஃபார்மிற்கும் எந்தவொரு வேகமான இழையும் 100% தூயதாக இருப்பதில்லை, மேலும் 70-90% வரம்பில் உள்ள MYH1 mRNA வெளிப்பாடு அளவுகள், புரத மட்டத்தில் சமமான MYH1 மற்றும் MYH2 செறிவை ஏற்படுத்துமா என்பதும் தெளிவாக இல்லை. இருப்பினும், முழு டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் அல்லது புரோட்டியோமைக் கருத்தில் கொள்ளும்போது, ​​அவற்றின் துல்லியமான MYH கலவையைப் பொருட்படுத்தாமல், மெதுவான மற்றும் வேகமான எலும்புத் தசை இழைகளைக் குறிக்கும் இரண்டு தனித்துவமான கிளஸ்டர்களை மட்டுமே கிளஸ்டர் பகுப்பாய்வு நம்பிக்கையுடன் அடையாளம் காண முடியும். இது ஒற்றை-கரு டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் அணுகுமுறைகளைப் பயன்படுத்தும் பகுப்பாய்வுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது, அவை பொதுவாக இரண்டு தனித்துவமான மயோநியூக்ளியர் கிளஸ்டர்களை மட்டுமே அடையாளம் காண்கின்றன. 68, 69, 70 மேலும், முந்தைய புரோட்டியோமிக் ஆய்வுகள் வகை 2X இழைகளை அடையாளம் கண்டிருந்தாலும், இந்த இழைகள் மற்ற வேக இழைகளிலிருந்து தனியாகக் குழுமமாகவில்லை, மேலும் MYH-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட மற்ற இழை வகைகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​வேறுபட்ட அளவில் காணப்படும் புரதங்களின் சிறிய எண்ணிக்கையை மட்டுமே காட்டுகின்றன. 14 இந்த முடிவுகள், நாம் 20 ஆம் நூற்றாண்டின் முற்பகுதியில் இருந்த தசை இழை வகைப்பாட்டுக் கண்ணோட்டத்திற்குத் திரும்ப வேண்டும் என்று பரிந்துரைக்கின்றன; அந்தக் கண்ணோட்டம் மனித எலும்புத் தசை இழைகளை MYH-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்டு மூன்று தனித்துவமான வகுப்புகளாகப் பிரிக்காமல், அவற்றின் வளர்சிதை மாற்ற மற்றும் சுருங்கும் பண்புகளின் அடிப்படையில் இரண்டு குழுமங்களாகப் பிரித்தது. 63
மிக முக்கியமாக, தசைநார் இழைகளின் பன்முகத்தன்மையை பல பரிமாணங்களில் கருத்தில் கொள்ள வேண்டும். முந்தைய "ஓமிக்ஸ்" ஆய்வுகள் இந்த திசையில் சுட்டிக்காட்டியுள்ளன, எலும்புத் தசை நார்கள் தனித்தனி கொத்துக்களை உருவாக்குவதில்லை, மாறாக ஒரு தொடர்ச்சியாக வரிசைப்படுத்தப்பட்டுள்ளன என்று கூறுகின்றன. 11, 13, 14, 64, 71 இங்கே, எலும்புத் தசையின் சுருங்கும் மற்றும் வளர்சிதை மாற்றப் பண்புகளில் உள்ள வேறுபாடுகளுக்கு கூடுதலாக, செல்-செல் இடைவினைகள் மற்றும் இடமாற்ற வழிமுறைகள் தொடர்பான அம்சங்களால் தசைநார் இழைகளை வேறுபடுத்த முடியும் என்பதை நாங்கள் காட்டுகிறோம். உண்மையில், எலும்புத் தசை நார்களில் ரைபோசோம் பன்முகத்தன்மையை நாங்கள் கண்டறிந்தோம், இது மெதுவான மற்றும் வேகமான நார் வகைகளைச் சாராமல் பன்முகத்தன்மைக்கு பங்களிக்கிறது. மெதுவான மற்றும் வேகமான நார் வகையைச் சாராத இந்த கணிசமான தசைநார் இழை பன்முகத்தன்மைக்கான அடிப்படைக் காரணம் தெளிவாக இல்லை, ஆனால் இது குறிப்பிட்ட விசைகள் மற்றும் சுமைகளுக்கு உகந்த முறையில் பதிலளிக்கும் தசைக்கற்றைகளுக்குள் உள்ள சிறப்பு இடஞ்சார்ந்த அமைப்பு,72 தசை நுண்சூழலில் உள்ள மற்ற செல் வகைகளுடன் சிறப்பு செல் அல்லது உறுப்பு சார்ந்த தொடர்பு73,74,75 அல்லது தனிப்பட்ட தசைநார் இழைகளுக்குள் ரைபோசோம் செயல்பாட்டில் உள்ள வேறுபாடுகளைச் சுட்டிக்காட்டலாம். உண்மையில், RPL3 மற்றும் RPL3L ஆகியவற்றின் இணை மரபணு பதிலீடு மூலமாகவோ அல்லது rRNA-வின் 2′O-மெத்திலேஷன் மட்டத்திலோ ஏற்படும் ரைபோசோமால் ஹெட்டிரோபிளாஸ்மி, எலும்புத் தசை மிகை வளர்ச்சியுடன் தொடர்புடையதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது76,77. தனிப்பட்ட தசை நார்களின் செயல்பாட்டுப் பண்புக்கூறுகளுடன் இணைந்த பல-ஓமிக் மற்றும் இடஞ்சார்ந்த பயன்பாடுகள், பல-ஓமிக் மட்டத்தில் தசை உயிரியல் பற்றிய நமது புரிதலை மேலும் மேம்படுத்தும்78.
நெமலைன் மயோபதி நோயாளிகளின் தனிப்பட்ட தசை நார்களின் புரோட்டியோம்களைப் பகுப்பாய்வு செய்வதன் மூலம், எலும்புத் தசையின் மருத்துவ நோயியலைத் தெளிவுபடுத்துவதில் தனிப்பட்ட தசை நார் புரோட்டியோமிக்ஸின் பயன்பாடு, செயல்திறன் மற்றும் பொருந்தக்கூடிய தன்மையையும் நாங்கள் நிரூபித்தோம். மேலும், எங்கள் பணிப்பாய்வை உலகளாவிய புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வுடன் ஒப்பிடுவதன் மூலம், தனிப்பட்ட தசை நார் புரோட்டியோமிக்ஸ், உலகளாவிய திசு புரோட்டியோமிக்ஸைப் போன்ற அதே ஆழமான தகவல்களை அளிக்கிறது என்பதையும், தசை நார்களுக்கு இடையேயான பன்முகத்தன்மை மற்றும் தசை நார் வகையைக் கணக்கில் எடுத்துக்கொள்வதன் மூலம் இந்த ஆழத்தை விரிவுபடுத்துகிறது என்பதையும் எங்களால் நிரூபிக்க முடிந்தது. ஆரோக்கியமான கட்டுப்பாட்டுக் குழுவினருடன் ஒப்பிடும்போது ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதிகளில் காணப்பட்ட, எதிர்பார்க்கப்பட்ட (மாறக்கூடிய) தசை நார் வகை விகித வேறுபாடுகளுக்கு¹⁹ கூடுதலாக, MYH-மத்தியஸ்த தசை நார் வகை மாற்றத்தைச் சாராத ஆக்ஸிஜனேற்ற மற்றும் புற-செல்லுலார் மறுவடிவமைப்பையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். TNNT1 நெமலைன் மயோபதிகளில் ஃபைப்ரோசிஸ் முன்னர் பதிவாகியுள்ளது.¹⁹ இருப்பினும், ACTA1 மற்றும் TNNT1 நெமலைன் மயோபதிகளால் பாதிக்கப்பட்ட நோயாளிகளின் மயோஃபைபர்களில், சார்கோலெம்மல் பழுதுபார்க்கும் வழிமுறைகளில் ஈடுபட்டுள்ள அனெக்சின்கள் போன்ற, செல்வெளி சுரக்கும் மன அழுத்தம் தொடர்பான புரதங்களின் அதிகரித்த அளவுகளையும் வெளிப்படுத்துவதன் மூலம் எங்கள் பகுப்பாய்வு இந்தக் கண்டுபிடிப்பை மேலும் வலுப்படுத்துகிறது.⁵⁷,⁵⁸,⁵⁹ முடிவாக, நெமலைன் மயோபதியால் பாதிக்கப்பட்ட நோயாளிகளின் மயோஃபைபர்களில் அதிகரித்த அனெக்சின் அளவுகள், கடுமையாகச் சிதைந்த மயோஃபைபர்களைப் பழுதுபார்ப்பதற்கான ஒரு செல்லுலார் பிரதிபலிப்பைக் குறிக்கலாம்.
இந்த ஆய்வு, இன்றுவரை மனிதர்களில் மேற்கொள்ளப்பட்ட மிகப்பெரிய ஒற்றை-இழை முழுத் தசை ஓமிக்ஸ் பகுப்பாய்வாக இருந்தாலும், இதில் சில வரம்புகளும் உள்ளன. நாங்கள் ஒப்பீட்டளவில் சிறிய மற்றும் ஒரே மாதிரியான பங்கேற்பாளர்களின் மாதிரியிலிருந்தும், ஒரே ஒரு தசையிலிருந்தும் (வாஸ்டஸ் லேட்டராலிஸ்) எலும்புத் தசை இழைகளைப் பிரித்தெடுத்தோம். எனவே, பல்வேறு தசை வகைகளிலும், தசை உடலியலின் உச்சநிலைகளிலும் குறிப்பிட்ட இழைத் தொகுதிகள் இருப்பதற்கான சாத்தியக்கூறுகளை முற்றிலுமாக நிராகரிப்பது இயலாது. உதாரணமாக, நன்கு பயிற்சி பெற்ற ஓட்டப்பந்தய வீரர்கள் மற்றும்/அல்லது வலிமை விளையாட்டு வீரர்களிடமோ79 அல்லது தசை செயலற்ற காலங்களில்66,80 அதிவேக இழைகளின் ஒரு துணைக்குழு (எ.கா., தூய 2X இழைகள்) தோன்றுவதற்கான சாத்தியக்கூறை எங்களால் நிராகரிக்க முடியாது. மேலும், பங்கேற்பாளர்களின் குறைந்த மாதிரி அளவு, இழைகளின் பன்முகத்தன்மையில் உள்ள பாலின வேறுபாடுகளை ஆராய்வதைத் தடுத்தது, ஏனெனில் இழை வகை விகிதங்கள் ஆண்களுக்கும் பெண்களுக்கும் இடையில் வேறுபடும் என்பது அறியப்பட்டதே. மேலும், ஒரே தசை இழைகள் அல்லது ஒரே பங்கேற்பாளர்களிடமிருந்து பெறப்பட்ட மாதிரிகளில் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வுகளை எங்களால் நடத்த முடியவில்லை. மிகக் குறைந்த மாதிரி உள்ளீட்டை அடைவதற்காக, ஓமிக்ஸ் பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி ஒற்றைச் செல் மற்றும் ஒற்றைத் தசைநார் பகுப்பாய்வுகளை நாங்களும் மற்றவர்களும் தொடர்ந்து மேம்படுத்தி வருவதால் (மைட்டோகாண்ட்ரியல் மயோபதி நோயாளிகளின் தசைநார்கள் பகுப்பாய்வில் இங்கு நிரூபிக்கப்பட்டதைப் போல), ஒற்றைத் தசைநார்களுக்குள் பல-ஓமிக்ஸ் (மற்றும் செயல்பாட்டு) அணுகுமுறைகளை இணைப்பதற்கான வாய்ப்பு தெளிவாகிறது.
ஒட்டுமொத்தமாக, எங்கள் தரவுகள் எலும்புத் தசை பன்முகத்தன்மையின் படியெடுத்தல் மற்றும் படியெடுத்தலுக்குப் பிந்தைய இயக்கிகளை அடையாளம் கண்டு விளக்குகின்றன. குறிப்பாக, இழை வகைகளின் பாரம்பரிய MYH-அடிப்படையிலான வரையறையுடன் தொடர்புடைய, எலும்புத் தசை உடலியலில் உள்ள ஒரு நீண்டகாலக் கோட்பாட்டிற்கு சவால் விடும் தரவுகளை நாங்கள் முன்வைக்கிறோம். இந்த விவாதத்தைப் புதுப்பித்து, இறுதியில் எலும்புத் தசை இழை வகைப்பாடு மற்றும் பன்முகத்தன்மை குறித்த நமது புரிதலை மறுபரிசீலனை செய்ய நாங்கள் நம்புகிறோம்.
பதினான்கு காகேசியப் பங்கேற்பாளர்கள் (12 ஆண்கள் மற்றும் 2 பெண்கள்) இந்த ஆய்வில் பங்கேற்கத் தானாக முன்வந்து ஒப்புக்கொண்டனர். இந்த ஆய்வு கென்ட் பல்கலைக்கழக மருத்துவமனையின் நெறிமுறைக் குழுவால் (BC-10237) அங்கீகரிக்கப்பட்டது, 2013 ஹெல்சிங்கி பிரகடனத்திற்கு இணங்கியது, மற்றும் ClinicalTrials.gov-இல் (NCT05131555) பதிவு செய்யப்பட்டது. பங்கேற்பாளர்களின் பொதுவான பண்புகள் துணை அட்டவணை 1-இல் வழங்கப்பட்டுள்ளன. வாய்மொழி மற்றும் எழுத்துப்பூர்வமான தகவலறிந்த ஒப்புதலைப் பெற்ற பிறகு, ஆய்வில் இறுதியாகச் சேர்க்கப்படுவதற்கு முன்பு பங்கேற்பாளர்கள் ஒரு மருத்துவப் பரிசோதனைக்கு உட்படுத்தப்பட்டனர். பங்கேற்பாளர்கள் இளம் வயதினராகவும் (22–42 வயது), ஆரோக்கியமாகவும் (எந்த மருத்துவ நிலைகளும் இல்லை, புகைப்பிடிக்கும் பழக்கம் இல்லை), மற்றும் மிதமான உடல் செயல்பாடு உடையவர்களாகவும் இருந்தனர். முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, உடல் தகுதியை மதிப்பிடுவதற்கான ஸ்டெப் எர்கோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி அதிகபட்ச ஆக்ஸிஜன் உட்கொள்ளல் தீர்மானிக்கப்பட்டது. 81
தசை திசு மாதிரிகள், 14 நாட்கள் இடைவெளியில், ஓய்வு நிலையிலும் உண்ணாவிரத நிலையிலும் மூன்று முறை சேகரிக்கப்பட்டன. இந்த மாதிரிகள் ஒரு பெரிய ஆய்வின் பகுதியாக சேகரிக்கப்பட்டதால், பங்கேற்பாளர்கள் திசுப் பரிசோதனைக்கு 40 நிமிடங்களுக்கு முன்பு பிளாசிபோ (லாக்டோஸ்), ஒரு H1-ஏற்பி எதிர்ப்பி (540 மி.கி ஃபெக்சோஃபெனாடின்), அல்லது ஒரு H2-ஏற்பி எதிர்ப்பி (40 மி.கி ஃபாமோடிடின்) ஆகியவற்றை உட்கொண்டனர். இந்த ஹிஸ்டமைன் ஏற்பி எதிர்ப்பிகள் ஓய்வு நிலையில் உள்ள எலும்புத் தசையின் தகுதியை பாதிக்காது என்பதை நாங்கள் முன்பே நிரூபித்துள்ளோம்81, மேலும் எங்கள் தரக் கட்டுப்பாட்டு வரைபடங்களில் (துணைப் படங்கள் 3 மற்றும் 6) நிலை தொடர்பான எந்தக் குழுமமும் காணப்படவில்லை. ஒவ்வொரு பரிசோதனை நாளுக்கும் 48 மணி நேரத்திற்கு முன்பு ஒரு தரப்படுத்தப்பட்ட உணவு (41.4 கி.கலோரி/கி.கி உடல் எடை, 5.1 கி/கி.கி உடல் எடை கார்போஹைட்ரேட், 1.4 கி/கி.கி உடல் எடை புரதம், மற்றும் 1.6 கி/கி.கி உடல் எடை கொழுப்பு) பின்பற்றப்பட்டது, மேலும் பரிசோதனை நாளின் காலையில் ஒரு தரப்படுத்தப்பட்ட காலை உணவு (1.5 கி/கி.கி உடல் எடை கார்போஹைட்ரேட்) உட்கொள்ளப்பட்டது. உள்ளூர் மயக்க மருந்தின் (எபிநெஃப்ரின் இல்லாத 0.5 மிலி 1% லிடோகெய்ன்) கீழ், தோலின் வழியே பெர்க்ஸ்ட்ரோம் ஆஸ்பிரேஷன் முறையைப் பயன்படுத்தி வாஸ்டஸ் லேட்டராலிஸ் தசையிலிருந்து தசை திசு மாதிரிகள் எடுக்கப்பட்டன.82 தசை மாதிரிகள் உடனடியாக RNAlater-இல் பதிக்கப்பட்டு, கைகளால் இழைகளைப் பிரித்தெடுக்கும் வரை (3 நாட்கள் வரை) 4°C வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டன.
புதிதாகப் பிரித்தெடுக்கப்பட்ட தசைநார் கற்றைகள், ஒரு வளர்ப்புத் தட்டில் உள்ள புதிய RNAlater ஊடகத்திற்கு மாற்றப்பட்டன. பின்னர், ஒரு ஸ்டீரியோமைக்ரோஸ்கோப் மற்றும் மெல்லிய இடுக்கியைப் பயன்படுத்தி தனிப்பட்ட தசைநார்கள் கையால் பிரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு திசுப்பரிசோதனையிலிருந்தும் இருபத்தைந்து நார்கள் பிரிக்கப்பட்டன; திசுப்பரிசோதனையின் வெவ்வேறு பகுதிகளில் இருந்து நார்களைத் தேர்ந்தெடுப்பதில் சிறப்பு கவனம் செலுத்தப்பட்டது. பிரித்தெடுத்த பிறகு, தேவையற்ற புரதங்கள் மற்றும் டிஎன்ஏ-வை அகற்றுவதற்காக, புரோட்டினேஸ் K மற்றும் டிஎன்ஏஸ் நொதிகளைக் கொண்ட 3 μl சிதைவு தாங்கல் கரைசலில் (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) ஒவ்வொரு நாரும் மெதுவாக மூழ்கடிக்கப்பட்டது. பின்னர், திரவத்தை ஒரு மைக்ரோசென்ட்ரிஃபியூஜில் சுழற்றி, அறை வெப்பநிலையில் (10 நிமிடம்) அடைகாப்பதன் மூலம் செல் சிதைவு மற்றும் புரதம்/டிஎன்ஏ நீக்கம் தொடங்கப்பட்டது. பின்னர், அந்த சிதைவுக் கரைசல் ஒரு வெப்பச் சுழற்சி கருவியில் (T100, Bio-Rad) 37°C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கும், 75°C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கும் அடைகாக்கப்பட்டு, மேலதிக செயலாக்கத்திற்காக உடனடியாக -80°C வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டது.
குவாண்ட்ஸீக்-பூல் 3′ mRNA-ஸீக் லைப்ரரி ப்ரெப் கிட் (லெக்சோஜென்) பயன்படுத்தி, 2 µl தசைநார் லைசேட்டிலிருந்து இல்லுமினா-இணக்கமான பாலிஅடினைலேட்டட் ஆர்.என்.ஏ லைப்ரரிகள் தயாரிக்கப்பட்டன. விரிவான வழிமுறைகளை உற்பத்தியாளரின் கையேட்டில் காணலாம். இந்த செயல்முறை, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மூலம் முதல்-இழை சி.டி.என்.ஏ தொகுப்புடன் தொடங்குகிறது. அப்போது, ​​மாதிரிகளை ஒன்றிணைப்பதை உறுதி செய்வதற்கும், அடுத்தகட்ட செயலாக்கத்தின் போது ஏற்படும் தொழில்நுட்ப மாறுபாடுகளைக் குறைப்பதற்கும், தனித்துவமான மூலக்கூறு அடையாளங்காட்டிகளும் (UMIs) மாதிரி-சார்ந்த i1 பார்கோடுகளும் அறிமுகப்படுத்தப்படுகின்றன. பின்னர், 96 தசைநார்களிலிருந்து பெறப்பட்ட சி.டி.என்.ஏ ஒன்றிணைக்கப்பட்டு, காந்த மணிகள் மூலம் சுத்திகரிக்கப்படுகிறது. அதன்பிறகு, ஆர்.என்.ஏ அகற்றப்பட்டு, ரேண்டம் பிரைமர்களைப் பயன்படுத்தி இரண்டாம்-இழை தொகுப்பு செய்யப்படுகிறது. லைப்ரரி காந்த மணிகள் மூலம் சுத்திகரிக்கப்பட்டு, தொகுப்பு-சார்ந்த i5/i7 டேக்குகள் சேர்க்கப்பட்டு, பி.சி.ஆர் மூலம் பெருக்கப்படுகிறது. ஒரு இறுதி சுத்திகரிப்பு படிநிலையானது இல்லுமினா-இணக்கமான லைப்ரரிகளை உருவாக்குகிறது. ஒவ்வொரு லைப்ரரி பூலின் தரமும், ஹை சென்சிட்டிவிட்டி ஸ்மால் ஃபிராக்மென்ட் டிஎன்ஏ அனாலிசிஸ் கிட் (அஜிலென்ட் டெக்னாலஜிஸ், DNF-477-0500) பயன்படுத்தி மதிப்பிடப்பட்டது.
Qubit அளவீட்டின் அடிப்படையில், தொகுப்புகள் சமமோலார் செறிவுகளில் (2 nM) மேலும் ஒன்றிணைக்கப்பட்டன. அதன் விளைவாகக் கிடைத்த தொகுப்பானது, NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 நியூக்ளியோடைடுகள்) மற்றும் 2 nM ஏற்றம் (4% PhiX) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, NovaSeq 6000 கருவியில் நிலையான முறையில் வரிசைப்படுத்தப்பட்டது.
எங்கள் பைப்லைன், லெக்சோஜனின் குவாண்ட்ஸீக் பூல் தரவு பகுப்பாய்வு பைப்லைனை (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) அடிப்படையாகக் கொண்டது. தரவுகள் முதலில் i7/i5 குறியீட்டின் அடிப்படையில் bcl2fastq2 (v2.20.0) கொண்டு டீமல்டிபிளக்ஸ் செய்யப்பட்டன. பின்னர், ரீட் 2 ஆனது i1 மாதிரி பார்கோடு அடிப்படையில் idemux (v0.1.6) கொண்டு டீமல்டிபிளக்ஸ் செய்யப்பட்டு, umi_tools (v1.0.1) கொண்டு UMI வரிசைகள் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. அதன் பிறகு, குறுகிய ரீட்கள் (<20 நீளம்) அல்லது அடாப்டர் வரிசைகளை மட்டுமே கொண்ட ரீட்களை நீக்குவதற்காக, cutadapt (v3.4) கொண்டு பல சுற்றுகளில் ரீட்கள் ட்ரிம் செய்யப்பட்டன. பின்னர், STAR (v2.6.0c) பயன்படுத்தி ரீட்கள் மனித மரபணுத்தொகுதியுடன் சீரமைக்கப்பட்டு, SAMtools (v1.11) கொண்டு BAM கோப்புகள் குறியிடப்பட்டன. umi_tools (v1.0.1) பயன்படுத்தி நகல் ரீட்கள் நீக்கப்பட்டன. இறுதியாக, Subread (v2.0.3)-இல் உள்ள featureCounts-ஐப் பயன்படுத்தி சீரமைப்பு எண்ணிக்கை மேற்கொள்ளப்பட்டது. செயல்முறைத் தொடரின் பல இடைநிலைக் கட்டங்களில் FastQC (v0.11.9)-ஐப் பயன்படுத்தி தரக் கட்டுப்பாடு செய்யப்பட்டது.
அனைத்து மேலதிக பயோஇன்ஃபர்மேட்டிக்ஸ் செயலாக்கமும் காட்சிப்படுத்தலும் R (v4.2.3)-இல், முதன்மையாக Seurat (v4.4.0) பணிப்பாய்வைப் பயன்படுத்திச் செய்யப்பட்டன. 83 எனவே, தனிப்பட்ட UMI மதிப்புகள் மற்றும் மெட்டாடேட்டா மேட்ரிக்ஸ்கள் Seurat ஆப்ஜெக்டுகளாக மாற்றப்பட்டன. அனைத்து இழைகளிலும் 30%-க்கும் குறைவாக வெளிப்படுத்தப்பட்ட மரபணுக்கள் நீக்கப்பட்டன. 1000 UMI மதிப்புகள் மற்றும் 1000 கண்டறியப்பட்ட மரபணுக்கள் என்ற குறைந்தபட்ச வரம்பின் அடிப்படையில் குறைந்த தர மாதிரிகள் நீக்கப்பட்டன. இறுதியாக, 925 இழைகள் அனைத்து தரக் கட்டுப்பாட்டு வடிகட்டுதல் படிகளையும் கடந்தன. அனைத்து 7418 கண்டறியப்பட்ட அம்சங்களையும் உள்ளடக்கி, Seurat SCTransform v2 முறையைப் பயன்படுத்தி UMI மதிப்புகள் இயல்பாக்கப்பட்டன, 84 மேலும் பங்கேற்பாளர்களுக்கு இடையிலான வேறுபாடுகள் பின்னடைவு செய்யப்பட்டன. தொடர்புடைய அனைத்து மெட்டாடேட்டாவையும் துணைத் தரவுத்தொகுப்பு 28-இல் காணலாம்.